Pankreas adacık kaynaklı MAFA+/PAX4+ kök hücrelerin kullanılmasıyla desellülerize karaciğer doku iskelesinin insülin salgılayan doku parçasına dönüştürülmesi

Abstract

AMAÇ: Sunulan tez çalışmasında sıçan karaciğerlerinin desellülarizasyonuyla elde edilen karaciğer doku iskelesinin Pax4 (paired box gene 4) ve MafA (musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A) genleri aktarılmış sıçan pankreatik adacık kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MafA+/Pax4+-sPA-MKH) ile resellülarizasyonu sonucu endokrin pankreas işlevine sahip doku üretimi amaçlanmıştır. YÖNTEM: Çeşitli deterjan serileri kullanılarak karaciğer hücrelerinden arındırılmıştır. Böylece doku ve organları oluşturmak için üzerinde hücrelerin tutunup çoğalmalarına olanak tanıyan 3 boyutlu doku iskelesi elde edilmiştir. Bu biyolojik materyalde hücresel bileşenlerin kalmadığı moleküler, histokimyasal ve immün floresan tekniklerle gösterilmiştir. Kültürde çoğaltılan MafA+/Pax4+-sPA-MKH'ler doku iskelesine ekilerek yeni bir kültür ortamına alınmışlar ve buraya tutunup çoğalmaları sağlanmıştır. Hücreler doku iskelesine ekildikten sonra standart besi yeri ile kültüre alındıklarında yalnızca matriksin farklılaştırma etkisi, endokrin farklılaştırma besi yeri ile kültüre alındıklarında da matriks etkisine ilaveten kimyasal uyarının etkisi birlikte incelenmiştir. Doku iskelesindeki hücrelerin pankreatik adacıklarda bulunan hücrelere farklılaşmalarını değerlendirmek için çeşitli belirteçler incelenmiştir. Bu inceleme immün floresan yöntemlerle boyanarak, Real Time PCR ile gen ekspresyon seviyesinde, ELISA kullanılarak protein seviyesinde yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar 2 boyutlu standart ve endokrin farklılaştırma besi yeri içeren kültürler ve pankreatik adacıklar ile karşılaştırılarak yöntemin etkinliği incelenmiştir.BULGULAR: Elde edilen sonuçlar desellülarizasyonun başarılı bir şekilde gerçekleştiğini göstermektedir. Karaciğer doku iskelesinin hücrelerin çoğalmalarını engellemediğini ve hücre bölünmelerinin devam etiği görülmüştür. Matriks içinde kültüre alınan hücrelerin 2 boyutlu hücre kültürü ile kıyaslandığında insülin gen ekspresyonunda ve insülin üretiminde çok daha verimli olduğu gözlemlenmiştir. SONUÇ: Hücresizleştirilen karaciğer doku iskelesinde hücresel herhangi bir bileşenin kalmadığı gösterilmiştir. Bu doku iskelesinin MafA+/Pax4+sPA-MKH'ler ile yeniden hücrelendirilmesi aşamasında ise hücrelerin matrikse tutunduğu ve bölünüp çoğaldıkları, matriksin etkisi ve endokrin yönde kimyasal uyarılma aşaması ile endokrin pankreas dokusuna benzer karakteristik özellikler gösteren bir yapıya büründükleri gözlemlenmiştir.

OBJECTİVE: In the proposed thesis study, it was aimed the production of tissue with endocrine pancreatic function by the recellularization of decellularized rat liver tissue scaffold with Pax4 ( paired box gene 4) and MafA ( musculoponeurotic fibrosarcome oncogene homolog A) transfected pancreatic islet derived mesenchymal stem cells (MafA+/Pax4+-PA-MKH). METHOD: By a serie of detergent applications, liver was removed from the cells. In this way, 3D tissue scaffold were derived supporting the cell adhesion and proliferation to generate tissue and organ structures. By molecular, histochemical and immunofluorescence techniques, the remnant of cellular component, including nucleic acids, was shown in this biological material. The cultured MafA+/Pax4+-sPA-MSCs was seeded onto the tissue scaffold, and cell adhesion and proliferation was provided. Following the recellularization, the effect of matrix was analyzed by culturing the cells in the standard culture medium, and the effect of chemical signalling beside the matrix was evaluated by culturing the cells in the endocrine differentiation medium. Various markers were analyzed for the evaluation of cell differention in the tissue scaffold into the pancreatic islet cells. These analyses were performed at protein level by immunoflourescence and ELISA methods and at gene level by Real-Time PCR method. The efficacy of this method was evaluated by comparing the observations to the 2D cultures supplemented with standard and endocrine differentiation medium, as well as with rat pancreatic islet cells.RESULTS: These results of study shows that decellularization was successfully completed. The capability of liver tissue scafold in supporting maintenance and expansion of cells were determined. In terms of insulin expressions and productions, 3D culture was much more efficient compared to 2D.CONCLUSİONS: İt was demonstrated that none of the cellular components were presented in the tissue scaffold of decellularized liver. At the recellularization stage of this scaffold with MafA+/Pax4+-sPA-MSCs, the adhessione and proliferation of the cells were observed under the influence of the matrix and chemical induction of differentiation into endocrine cells.