Duyusal sinir hücrelerinde melatoninin voltaj bağımlı kalsiyum kanallarına etkisi

Abstract

46 5. ÖZET Pineal hormon melatonin (/V-asetil-5-metoksitriptamin) aralarında reprodüksiyonun mevsimsel kontrolü, sirkadiyan fizyolojiye etki, termoregülasyon, kardiyovasküler ve immun fonksiyonların yer aldığı çeşitli biyolojik ve hücresel etkilere sahiptir. Melatoninin sıçan pineal hücrelerinin dahil olduğu çeşitli preparatlarda hücre içi serbest kalsiyum düzeyini modüle etmesine ilaveten kalsiyum iyonlarının melatoninin biyosentez ve salınmasında rol oynadığı bilinmektedir. Bu çalışmanın amacı sıçan dorsal kök gangliyon (DKG) hücre kültürlerinde melatoninin voltaj bağımlı kalsiyum kanal akımlarına etkilerini araştırmaktı. Dekapitasyondan sonra dorsal kök gangliyonları 1-2 günlük yeni doğan sıçanlardan uzaklaştırılarak enzimatik ve mekanik işlemlerle tek hücrelere ayrıştırıldı. Hücreler daha sonra esansiyel vasatları içeren cam lameller üzerine ekilerek 37°C'de %5 C02 içeren nemli inkübatörde inkübe edilerek, 1-1.5 gün içerisinde kullanıldı. Bu hücrelerden kayıt için tüm hücre diyaliz patch kenetleme. tekniği kullanıldı. Voltaj bağımlı kalsiyum kanal akımları tetrodotoksin içeren ekstrasellüler kolin klorür esaslı kayıt ve hücre içi sezyum klorür esaslı patch pipet solüsyonu kullanılarak farmakolojik olarak izole edildi. Hücreler -90 mili voltta (mV) tutuldu ve 100 milisaniye süreli depolarize edici voltaj kare dalgaları ile 0 mili volta depolarize edilerek yüksek voltajla aktive olan kalsiyum kanal akımları aktive. edildi. Yüksek voltajla aktive olan kalsiyum kanal akımları arasında alt tiplendirme yapılmadı. Üç adet stabil amplitütlü kalsiyum kanal akımı kayıt edildikten sonra basınçla enjeksiyonla melatonin kör bir pipetten hücre dışına uygulandı. 1 ve 10 /M melatonin uygulamaları kalsiyum kanal akımlarını anlamlı düzeyde inhibe etti. Kalsiyum kanal akımlarının pik amplitütleri kontrol koşullarında -1.39±0.17 nA (n=6) ve 1 j.ıM melatonin uygulamasından sonra -1.00±0.13 nA (n=6, P<0.05) olarak tespit edildi. 10 iM melatoninin etkisi de çalışıldı ve bu doz melatonin kontrol koşullarında kalsiyum kanal akımı pik amplitüt ortalamasını-1.40+0.1 nA'den (n=6) -0.48±0.03 nA'e (n=6, PO.02) inhibe etti.47 Sonuç olarak melatonin sıçan DKG hücrelerinde voltaj bağımlı kalsiyum kanal akımlarını inhibe etmektedir. Melatoninin yüksek voltajla aktive olan kalsiyum kanal akımları üzerine inhibitor etkisinin kesin rolleri bilinmemekle birlikte bu duyusal nöronların uyarılabilmesinin kontrolü ile bu nöronlarda kalsiyum bağımlı fizyolojik ve patofizyolojik olaylarda potansiyel rolü olduğu sanılmaktadır.

48 6. SUMMARY The pineal hormone melatonin (/V~acetyl-5-methoxytryptamine) has several biological and cellular effects including seasonal control of reproduction, influence in circadian physiology, thermoregulation, neuroendocrin, cardiovascular and ' immune functions. It is known that calcium ions play an important role biosynthesis and release of melatonin as well as melatonin's modulatory actions in, intracellular free calcium levels in some preparations including in rat pituitary. The aim of this study was to investigate the actions of melatonin on voltage activated calcium channel currents in cultured rat dorsal root ganglion (DRG) neurones. Dorsal root ganglia were removed from 1-2 day old neonatal rats after decapitation and DRG neurones were isolated by enzymatic and mechanical procedures. The cells than placed on coverslips in essential culture medium and kept in humidified incubator at 37°C containing %5 C02 before being used within 1- 15 days after culturing. The whole cell variant of the patch clamp technique used _ to record from these cells. The voltage activated calcium currents were pharmacologically isolated using choline chloride-based extracelular recording medium containing tetrodotoxin and caesium-chloride based intracellular patch pipette solution. The cells were voltage clamped at -90 milivolts (mV) and 100 millisecond depolarising voltage steps to 0 mV were injected to activate high voltage-activated calcium currents. No attempt was made differentiating between the high voltage activated calcium currents. After obtaining three consecutive calcium currents with stable amplitude melatonin was applied extracellularly by pressure ejection via a blunt pipette placed close to the cell being recorded. Application of 1 and 10 f.iM melatonin significantly inhibited calcium currents. The mean peak amplitude of calcium currents was -1.39+0.17 nA (n=6) under control conditions and -1.00+0.13 nA (n=6, P<0.05) after application of 1(.iM melatonin. The effects of 10(.iM dose of melatonin was also studied and peak amplitude of calcium currents were -1.40±0.1 nA (n=6) and -0.48±0.03 nA (n=6, PO.02) under control conditions and after application of 10j.iM melatonin, respectively.49 In conclusion melatonin inhibits voltage activated calcium currents in cultured rat DRG neurones. The exact role of this inhibitory effect of melatonin on high voltage-activated calcium currents in these neurones is unknown but it may be of importance in control of excitability of these sensory neurones as well as potential role(s) in other Ca+2-dependent physiological and pathophysiological processes.