Fenilketonürili hastalarda PAH genindeki mutasyonun VNTR ile bağlantısının saptanması ve Ddel enzimi direkt mutasyon analizi bulguları ile karşılaştırılması

Abstract

ÖZET Bu çalışmada, PKU tanısı konulmuş hasta bir çocuğa sahip 20 ailede, hasta çocuğun kardeşlerinin taşıyıcı olup olmadıklarını saptamak için PAH geni dışındaki VNTR polimorfizimlerinden faydalanarak alel segregasyonu yapılmıştır. Hastalarda IVS10nt546 mutasyonun varlığını araştırmak için Ddel restriksiyon enzimi direkt mutasyon analizi yöntemi uygulanmıştır. DNA venöz kandan ekstrakte edilmiştir. Ekstragenik VNTR dizileri PCR kullanılarak amplifiye edilmiş ve alel segregasyonu yapmak için de PCR ürünü jelde yürütülmüştür.İnformatif ailelerde hasta çocuğun kardeşlerinin taşıyıcılığı tesbit edilmiştir. Yirmi aileden 18 tanesi informatif, 9 çocuk taşıyıcı ve 6 çocuk sağlam bulunmuştur. İnformatif ailelere prenatal tanı yapılabileceği bildirilmiştir. Aynı hasta çocuklarda IVS10nt546 mutasyonuna yönelik olarak amplifiye edilen PAH geni PCR ürünü DdeI restriksiyon enzimi ile direkt mutasyon analizine tabi tutulmuştur. Toplam 40 alelden 12 sinde (%30) IVS10nt546 mutasyonu bulunmuştur. PAH-VNTR polimorfizimleri ile alel segregasyonu yapılamayan bir ailede hasta çocuğun İVS10nt546 mutasyonunu homozigot olarak taşıması, kardeşinin PKU taşıyıcısı olduğunu ortaya koymamızı sağlamıştır. Yalnız başına PAH-VNTR polimorfizimleri ile taşıyıcı tespiti başarısı %90 iken, Ddel restriksiyon enzimi direkt mutasyon analizi yöntemiyle birlikte kullanıldığında başarı oranı %95 e çıkmıştır. ANAHTAR KELİMELER: Fenilketonüri, PAH geni, PCR.VNTR, Ddel enzimi,

SUMMARY In this dissertation, allele segregation was performed utilizing VNTR polymorphisms outside the PAH gene in order to determine whether the siblings of a child who has been diagnosed with PKU are carriers. Blood samples from 20 children who had PKU and their parents as well as their siblings were studied. Ddel restriction enzyme direct mutation analysis technique was applied to determine whether the IVS10nt546 mutation existed in patients. DNA was extracted from the venous blood sample. The extragenic VNTR sequences were amplified using PCR, and the PCR product was run on the gel for allele segregation. With this process, it was determined whether a sibling of a sick child is a carrier in `informative` families. With this method, 18 families out of 20 were found to be `informative`; 9 children, carriers; 6 children, normal. It was concluded that the prenatal diagnosis was applicable to those informative families. In the samples from the PKU patients, the PAH gene which was amplified by PCR regionally including the IVS10nt546 mutation. IVS10nt546 mutation was found in 12 alleles out of 40 (30 %) by digesting the PCR products with Ddel restriction enzyme. In a noninformative family, where the allele segregation with PAH-VNTR polymorphism failed, a sick child was found to carry IVS1 0nt546 mutation homozygote. This led to the conclusion that the sibling of the child was a PKU carrier. While the success rate in carrier determination was 90% with PAH-VNTR polymorphism alone, the rate increased to 95 % when Ddel restriction enzyme direct mutation analysis was used additionally. KEY WORDS: Phenylketonuria (PKU), PAH gene, PCR, VNTR, Ddel restriction enzyme