Proteinlerin fluoresans maddeler ile işaretlenmesi

Abstract

ÖZET Fluoresans madde ile işaretlenen antikorlar, antijenler ve DNA oligonükleotidleri biyolojik maddelerin tayininde yer alan analiz yöntemlerinin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu fluoresans maddeler proteinlerin amino asit yan zincirlerine ya da oligonfikleotidlere eklenen modifîye bazların özel gruplarına kovalent olarak bağlanmaktadır. Bu çalışmada BSA'nın Fluoresein izotiyosiyanat (FITC) ile işaretlenme işlemi farklı reaksiyon koşullarında incelendi. Daha sonra, protein A kolonu ite saflaştırılan Anti-CD4 monokkraal antikorları FITC ile işaretlendi. Anti-CD8 antikor örneği için ön saflaştırma yapılmadı. Doğrudan FITC ile işaretleme gerçekleştirildi. İşaretli anti-CD8 antikorlarının lenfosit yüzeyine bağlanması `flow-cytometry* ile gözlendi. Ek olarak, BSA'nın pirenil izotiyosiyanat ile bağlanması incelendi. Anti-CD8 antikorları da bu madde ile işaretlendi. `Time-Master` spektrofluorometre kullanılarak bu işaretli BSA ve antikorların fluorasans bozunma grafikleri ve zaman ayırımh fluoresans spektrumlan (TRES) alındı, fluoresans ömürleri hesaplandı. vuı

ABSTRACT Antibodies, antigens or DNA oligonucleotides labeled with fluorescent substances are widely used for the development of analytical methods applied for the determination of biological substances. These fluorescent substances have been bound covalently to amino acid residues of protein or to the special groups of the modified bases added to the oligonucleotide. Usually lysin residues are preferred for the labelling reactions. In this work, the labeling of BSA with Fluorescein isotiocyanate (FITC) was studied in different reaction conditions. After BSA labeling, anti-CD4 monoclonal antibody purified by using protein A column was labeled with FITC. Anti-CD8 monoclonal antibody sampels were not purified directly labeled with FITC. The bounding to anti-CD8 antibodies of the lymphocyte surfaces were observed using Flow Cytometry. In addition, the labeling of BSA with pyrenyl isothiocynate was studied. Anti-CD8 antibodies were also labeled with this substance. Fluorescence decay, time-resolved emission spectra (TRES) of these labeled substances were obtained with Time Master Spectrofluorometer, and fluorescence lifetimes were calculated. IX