Canine parvovirus`e ait antijenik özellikli sentetik peptidlerin sentezi ve biyokonjugatlarının geliştirilmesi

Abstract

Yeni ve etkili polimerik sistemlerin geliştirilmesi ve spesifik kontrollü dağılım formülasyonlarının hazırlanıp uygulanması, uzun etkili peptid taşıyıcılar biyoteknolojide ileri ilaç ve aşı uygulamaları amacı ile yoğun biçimde araştırılan bir konudur. Polimerlerin peptid, protein vb. biyomoleküllerle etkileşiminin incelenmesi canlı organizmadaki davranışlarının anlaşılması ve biyokonjugasyon teknolojisinin geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Peptidlerin taşıyıcı moleküllere bağlanması, zayıf immunojenik özellikteki peptidlere karşı antikor oluşturmak için gerekmektedir. Suda çözünebilen biyopolimerlerin karboksil gruplarının aktivasyonu ve bunlara amino grupları içeren peptidlerin kovalent bağlanması bu tez çalışmamızın konusu olan Canine Parvovirus'e ait antijenik özellikli sentetik peptidlerin biyokonjugatlarının sentezlenmesi reaksiyonunun temelini oluşturmaktadır.Bu tez çalışmasının birinci aşamasında Canine Parvovirus'e ait W-7L20 sentetik peptidi katı faz peptid sentez metodu ile sentezlendi ve PAA polimeri ile biyokonjuge edildi. Buna ek olarak ticari olarak satın alınan W-1L19 sentetik peptidinin Polialkrilikasid, Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid), Karboksimetilselülaz polimerileri ile Canine Parvoviruse ait antijenik peptid bölgelerinin ?1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorid (EDC)? çapraz bağlayıcısı varlığında suda çözünebilen polimer-peptid biyokonjugatları sentezlendi. Biyokonjugatlar bir polimer molekülü için peptidin farklı molar oranlarında (npep/npol) ve bir peptid molekülü için polimerlerin farklı molar oranlarında (npol/npep) sentezlendi. Sentez basamağının ardından; Peptid-Polimer biyokonjugatları oluşum mekanizması, elektrik yükü ve üç boyutlu yapısının incelenmesi amacı ile peptid ve reaksiyonda kullanılan polimer ile karşılaştırmalı olarak HPLC, GPC, Zetasizer ve Fluoresans Spektrofotometre cihazları ile analiz edildi.Çalışmanın ikinci aşamasında ise Canine Parvoviruse ait antijenik peptid molekülünün hem tek başına hem de Floresein izotiyosiyanat (FITC) boyası ile beraber yüklendiği Poli(laktik-ko-glikolik)asid (PL-GA) esaslı nanopartiküller üretildi. Üretilen nanopartiküllerin boyut ve zeta potansiyel analizleri Zetasizer cihazı ile gerçekleştirildikten sonra GPC cihazında PL-GA polimeri ile karşılaştırmalı olarak kromatogramları alındı. FT-IR analizleri de gerçekleştirilen nanopartiküllerin daha sonra AFM ve SEM görüntüleri alındı. Nanopartiküllerin peptid yükleme kapasiteleri ve salım özellikleri AFM ve UV spektrofotometre ile incelendi. Üretilen nanopartiküllerin sitotoksik özellikleri, peptid ile karşılaştırmalı olarak Fare fibroblast hücreleri (L-929) ile değerlendirildi.Bu tez kapsamında elde edilecek bilgiler Canine Parvovirüsün oluşturduğu kanlı ishal hastalığına karşı spesifik antikorların elde edilmesi, tanı kitlerinin ve biyosensörlerin oluşturulması ve sentetik aşıların geliştirilmesi yönünde yapılacak çalışmalara ışık tutacak bir ön çalışma olacaktır.Ayrıca tez kapsamında üretilen nanopartiküller; ileriki çalışmalarda antijenik peptidlerin kontrollü salımı ve buna dayalı biyoteknolojik aşıların geliştirilmesi için ümit vadeden taşıyıcılardır.Anahtar Kelimeler: Canine Parvovirus, sentetik peptid sentezi, polimerlerin biyokonjugasyonu, Poli(D,L-laktik-ko-glikolik asit), nanopartikül

The development of new and effective polymeric systems and the preparation-application of specific controlled delivery formulations, long-action peptide carrier extensively studied subject in biotechnolgy with the aim of further applications of drug and vaccine. Interaction of polymers with peptide, protein ect. biomolecules is great importance for understanding the action mechanism of biopolymers in organism and development of bioconjugation technology. Coupling of peptides to carrier molecules is required to antibody production against weak immunogenic peptides. Activation of carboxyl groups of water soluble biopolymers and covalent binding of peptides amino groups is basis of bioconjugation reaction of antigenic synthetic peptide of Canine Parvovirus which subject of this thesis.In the first part of this PhD. thesis W-7L20 synthetic peptide of Canine Parvovirus is synthezied by Solid Phase Peptide Synthesis Method and bioconjugated to PAA polymer. Furthermore commercially purchased W-1L19 synthetic peptide-Polymer bioconjugates with polyacrylic acid, poly(N-vinyl-2-pyrrolidone-co-acrylic acid), carboxymethylcelulase synthesized in the presence of ?1-ethyl-3-3-dimethyl aminopropyl karbodiimid? cross-linker. Bioconjugates were synthesized different ratio of peptides for one polymer molecule (npep/npol) and different ratio of polymer for one peptide molecule (npol/npep). After the syntesis step, peptide-polymer bioconjugates comperatively analyzed with peptide and polymers, for investigation of formation mechanism, electrical charge and three dimensional structure by using HPLC, GPC, Zetasizer and Fluorescence Spectrophotometer.In the second part of this PhD. thesis only Canine parvovirus synthetic peptide and peptide+fluorescein isothiocyanate (FITC) loaded Poly(lactide-co-glicolide)acid (PL-GA) nanoparticles produced. After the analyses of produced nanoparticle?s size and zeta potential analyses by Zetasizer, the chromatograms receipt by GPC comperatively by PL-GA polymer. After performed FT-IR analyses of nanoparticles, AFM and SEM analysed were done. Peptide loading capacity and release properties of nanoparticles analyzed by AFM and UV Spectrophotometer. Cytotoxic properties of produced nanoparticles was evaluated against mouse fibroblast cells (L-929) in comparison with peptide.Information to be obtained within the scope of this thesis is to shed light on the direction of, to obtain specific antibodies against bloody diarrhea which caused by Canine parvovirus, generation of diagnostic kits and biosensors and development of synthetic vaccines will be a pre-study.In addition, nanoparticles produced in this thesis are promising carriers for controlled release of antigenic peptides and for the development of biotechnological vaccines based on this.