Protein-based biocomposite cryogels as tissue engineering scaffolds

Abstract

Bu tezin amacı protein bazlı makrogözenekli hidrojellerin (kriyojeller) hazırlanması ve doku iskelesi olarak doku mühendisliği için potansiyel uygulamalarının araştırılmasıdır.Bu çalışmada ilk kez ovalbumin/hidroksiapatit doku mühendisliği iskeleleri hazırlandı ve bu iskelelerin karakterizasyonları yapılarak, hücrelerin canlılığı ve malzemelerin biyouyumluluğu incelendi. İlk olarak, ovalbumin kriyojelleri, çapraz bağlanma reaksiyonlarının çözücünün donma noktasının altındaki sıcaklıklarda gerçekleştiği kriyojelasyon yöntemi ile sulu ortamda hazırlandı. Kriyojellerin hazırlanmasında kullanılan gluteraldehit gibi çapraz bağlayıcılar hücreler üzerinde toksik etki gösterdiğinden, ovalbumin kriyojelleri kovalent olmayan etkileşimler ile sentezlendi. Ovalbumin, sulu üre çözeltilerinde çözülerek düşük sıcaklıklarda donduruldu. Bu işlem ovalbumin proteininin katlanmasına neden olarak hidrofobik/elektrostatik etkileşimler ile kriyojellerin sentezlenmesine olanak sağladı. Bu metod ile, üstün gözeneklilik ve mekanik özelliklere sahip yeni ovalbumin/hidroksiapatit kriyojelleri sentezlendi. Polimer konsantrasyonu ve hidroksiapatit miktarı gibi sentez parametrelerinin kriyojeller üzerindeki etkileri incelendi.Üretilen bütün kriyojellerin jel fraksiyonu, denge şişme oranı, şişme kinetiği, mekanik özellikleri ve içyapı morfolojileri araştırıldı. Kriyojellerin gözenek yapıları taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelendi. SEM ölçümü sonuçlarıyla, kriyojellerin 30-70 µm boyutlarında birbirleriyle bağlantılı gözenekli bir içyapıya sahip oldukları görüldü. Şime sonuçları ise kriyojellerin kuru ağırlıklarının 10-30 katı kadar suyu birkaç saniye içinde absorplayabildiklerini gösterdi. Ayrıca, kriyojellerin kuvvet altında, hiçbir çatlak oluşmadan tamamen sıkıştırılabildikleri görüldü. Bu sonuçlarla kriyojellerin doku mühendisliğinde potansiyel uygulamaları olan yeni biyomateryaller oldukları anlaşıldı. Çalışmanın son kısmında ise, ovalbumin/hidroksiapatit biyokompozit kriyojelleri, in vitro ortamda 10T1/2 fare embriyonik fibroblast hücre hattı ile birleştirildi. Kriyojel doku iskelelerinin biyouyumlulukları bu fibroblast hücreleri kullanılarak araştırıldı. Bu bağlamda, 10T1/2 fibroblast hücrelerinin canlılığı ve yayılması diğer bir değişle; kriyojellerin biyouyumlulukları incelendi. Yapılan bu hücre kültürü çalışmaları, ovalbumin/hidroksiapatit biyokompozit kriyojellerinin ovalbumin kriyojellerine kıyasla hücrelerin yayılması ve çoğalması için daha uygun bir ortam oluşturduğunu gösterdi.

The aim of this thesis is to prepare various protein-based macroporous hydrogels (cryogels) and to investigate their potential as scaffolds for bone tissue engineering applications.This study is unique to explore cell viability and biocompatibility of ovalbumin/hydroxyapatite cryogel scaffolds as tissue engineering constructs. Here, ovalbumin cryogels were prepared in aqueous solutions by cryogelation method in which the crosslinking reactions are carried out at temperatures below the freezing point of the reaction solvent. It was decided to prepare ovalbumin cryogels by non-covalent interactions in order to eliminate the harmful effects of the toxic chemical crosslinkers such as glutaraldehyde on the cells. Ovalbumin was dissolved in aqueous urea solutions, and then these solutions were kept at subzero temperatures. This process resulted in unfolding of ovalbumin protein and formed cryogels via hydrophobic and electrostatic interactions. Using this method, novel ovalbumin/hydroxyapatite cryogels were obtained with superior porous structure and mechanical properties. The influence of varying polymer concentration and hydroxyapatite amount on the cryogel properties were investigated.All of the produced cryogels were characterized by gel fraction, equilibrium swelling, swelling kinetics, mechanical properties and internal morphology measurements. The porosity of the cryogels was observed by scanning electron microscopy (SEM). The results revealed that, the produced cryogels have interconnected macroporous structure with pore size of 30-70 µm. The swelling results of the gels showed that the dry samples could swell 10-30 folds of their drying weights in a few seconds. Furhermore, the cryogel could be compressed totally without any crack formation. These results proved that the cryogels could be used as scaffolds for tissue engineering applications. In the last part of the study, ovalbumin/hydroxyapatite biocomposite cryogels were combined with 10T1/2 mouse embryonic fibroblast cells in vitro. Biocompatibility of cryogel scaffolds was investigated by using these fibroblast cells. The viability and proliferation of 10T1/2 fibroblast cells, that is, the biocompatibility of the cryogels, was explored within these scaffolds. The results of the in vitro cell studies showed that the ovalbumin/hydroxyapatite biocomposite cryogels were preferable biomaterials than ovalbumin cryogels as they provide a better environment for the cells.