Kuraklık stresi sırasında uyarılan nac transkripsiyon faktörünün rangpur laym`dan izolasyonu, karakterizasyonu ve turunç anacına genetik transformasyonu

Abstract

Çevresel stres faktörleri dünyadaki bütün bitkilerin büyümesini, üretimini ve dağılmasını sınırlayan en önemli faktörler olarak bilinmektedir. Abiyotik stres faktörlerinden biri olan kuraklık ise doğal dengeyi olumsuz olarak etkilemektedir. Dünya üzerinde giderek etkisini artıran kuraklık, ülkemizde ve dünyada diğer meyve türlerinde olduğu gibi turunçgil yetiştiriciliğini de olumsuz yönde etkilemektedir. Türkiye'de ve Akdeniz kuşağında turunçgil yetiştiriciliğinde yaygın olarak kullanılan turunç (Citrus aurantium) anacı kuraklığa orta şiddette tolerans göstermektedir. Bu nedenle kuraklığa dayanıklı anaç geliştirilmesi ülkemizde turunçgil ıslahının ana amaçlarından birini oluşturmaktadır. Daha önce yapılan bir çalışmada Rangpur laym (Citrus x limonia) bitkilerine kuraklık stresi uygulandığında uyarılan genler arasında kuraklık dayanımında etkili olan bir NAC geni bulunmuştur. Bu çalışmada kısmi baz dizilimi bilinen bu NAC geninin RACE yöntemiyle 5' ve 3' uçları bulunarak bu NAC geninin tamamı elde edilmiştir. Tüm gen olarak izole edilen NAC geni ClNAC olarak tanımlanmıştır ve farklı turunçgil anaçlarında kuraklık stresi sırasında ekspresyonu incelenmiştir. Yapılan gen ekspresyon analizleri sonucunda 14 günlük kuraklık stresi uygulaması sırasında ClNAC geninin ekspresyonu Rangpur laym bitkilerinde artarken turunç anacında herhangi bir artış göstermemiştir. Bu nedenle bu çalışma kapsamında turunç anacının kuraklık stresine karşı toleransını artırmak amacıyla ClNAC geni Agrobacterium tumefaciens aracılığı turunç anacına aktarılmaya çalışılmıştır. Bu amaçla NAC geni RT-PCR yöntemi ile tüm gen olarak çoğalılarak Karnabahar mozaik virüsü (CaMV) 35S promotör ve terminatör bölgeleri arasına klonlanmıştır. Elde edilen tüm gen daha sonra pCAMBIA-1304 binary plazmitinin T-DNA bölgesine klonlanarak Agrobacterium tumefaciens'e aktarılmıştır. Elde edilen tüm NAC geni daha önce geliştirilen ve turunçgilerde yaygın olarak kullanılan Agrobacterium aracılığı ile gen transformasyon yöntemi kullanılarak tohumlardan yetiştirilen turunç epikotil parçalarına aktarılmıştır. Transformasyon yapılan epikotil parçalarından doğrudan organogenez yoluyla rejenerasyonu yapılarak potansiyel transgenik sürgünler oluşturulmuştur. Elde edilen sürgünlerin transgenik olup olmadıklarını histokimyasal GUS boyaması ve PCR yöntemiyle test edilmiştir. Ancak yapılan GUS veya PCR testlemeleri sonucunda test edilen sürgünlerin tamamı negatif sonuç vermiş olup elde edilen sürgünlerden hiçbirinden transgenik bitki elde edilememiştir. Çalışma soncunda transgenik bitki elde edilmemiş olmasına rağmen kuraklık ile ilişkili bir NAC geninin izolasyonu, ekspresyon analizi ve gen aktarım vektörüne klonlaması yapılarak, turunç anacına genetik trasformasyonun ve rejeneresyonunun optimizasyonu yapılmıştır.

Environmental stress factors are known to be the most important factors limiting the growth, production and distribution of all plants in the world. Drought, which is one of the abiotic stress factors, adversely affects the natural balance. The drought, which increases its effect on the world, negatively affects the citrus culivation as it is in other fruit species in Turkey and in the world. Sour orange (Citrus aurantium) rootstock is widely used rootstock in the culivation of citrus in Turkey and the Mediterranean Basin and is only moderately tolerant to drought. Therefore, the development of drought-resistant rootstock is one of the main aims of citrus breeding in Turkey. A partial sequence of a NAC gene induced by drought stress was previously identified form Rangpur lime (Citrus x limonia) rootstock. In this study, the 5' and 3' ends of this NAC gene were determined by RACE method and the full-length gene was isolated from the leaves of drought treated Rangpur lime rootstock. The full-length NAC gene was designated as ClNAC and its expression in response to drought was analyzed in different citrus rootstocks. The expression analysis showed that while the expression of ClNAC gene was increased in Rangpur lime, it was not induced at all in sour orange during 14-day drought treatment. Therefore, the ClNAC gene was transferred to sour orange by Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation method to improve drought tolerance of sour orange rootstock. For this, the full-length ClNAC gene was amplified by RT-PCR and cloned between Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and terminator regions. The gene casset was then cloned into the T-DNA region of pCAMBIA-1304 binary plasmid and transferred to Agrobacterium tumefaciens. The ClNAC gene was transferred to the sour orange (C. aurantium) epicotyl segments grown from seeds using the Agrobacterium-mediated transformation method previously developed and commonly used in citrus transformation. Potential transgenic shoots were regenerated from transformed epicotyl segments by direct organogenesis. The transgenic nature of regenerated shoots were tested by histochemical GUS staining and PCR methods. However, all tested shoots were negative for GUS and PCR tests indicating that no transgenic shoots were obtained. Alhough no transgenic plants were obtained in this study, a drought induced NAC gene was isolated, its expression was analyzed, and the gene was cloned into gene transformation vector. In addition, genetic transformation and regeneration of transgenic sour orange was optimized in this study.