Staphylococcus aureus teichoic asit antikorlarının çeşitli serolojik yöntemlerle araştırılması

Abstract

43 ÖZET Son yıllarda, stafilokoksik enfeksiyonların tanısında kullanılmak üzere hücre dışı ve hücre duvar antijenlerine karşı meydana gelen antikorların tanımlanmasında enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), counter- immuno electrophoresis(CÎE), radio-immunoassay(RIA) ve agar-gel diffusion(AGD) gibi yeni yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmada, Staphylococcus aureus(S. aureus) enfeksiyonlarında klinik tanıya yardımcı olmak amacıyla hücre duvar antijeni olan teichoic acid(TA)' e karşı oluşan Ig G antikorları agar gel diffusion (AGD) kiti (ENDO- STAPH, Meridian Diagnostics) ve laboratuarımızda hazırladığımız ELISA kiti ile araştırılmıştır. Değişik grup S. aureus enfeksiyonlarında TA özgül Ig G antikorlarını araştırmak üzere ELISA sistemi hazırlandı. Triklorasetik asit ekstraksiyonu sonucu pürifiye TA el?e edildi ve polistren mikrotitrasyon plakları 4 mikrogram/ml olacak şekilde antijen kaplandı. Bilinen pozitif ve negatif kontroller kullanılarak test uygulandı. Staphylococcus aureus(S. aureus) enfeksiyonu olan değişik grup 45 hastadan (3 endokardit, 7 akut osteomiyeiit, 15 kronik osteomiyelit, 5 abse, 3 pnömoni, 6 yüzeyel yara enfeksiyonu ve 3 septik artrit), ayrıca 10 adet S. aureus burun taşıyıcısı, 6 adet S. aureus dışı gram pozitif ve 6 adet gram negatif bakteri enfeksiyonlu hastadan serum toplandı. Ek olarak yaş gruplarına uyan antikor düzeylerini belirlemek üzere 18-63 yaş arası 100 adet sağlıklı kontrol ve 0-15 yaş arası 15 adet sağlıklı çocuktan serumlar toplandı. Hasta ve kontrol gruplarının tümünde ELISA yöntemiyle, 20 hasta ve 4 kontrol birey serumlarında AGD yöntemiyle Ig G düzeyleri ölçüldü. Hasta grupları ve kontrol grubu arasındaki istitiksei karşılaştırmalar Student t testi ile değerlendirildi. S. aureus endokarditi ve absesi olan hasta grubunda belirlenen Ig G düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek bulundu(p<0.001). Akut osteomiyelitli (p<0.01) ve kronik osteomiyelitli hasta grubu (p<0.05) sonuçları da kontrol grup sonuçlarına göre anlamlı düzeyde yüksek bulundu. Diğer gram pozitif ve gram negatif bakteri enfeksiyonu olanlarda çapraz reaksiyonlar gözlenmedi. Bu sonuçlar gozönünde bulundurulduğunda, TA antikor yüksek düzeylerinin derin doku44. yerleşimli enfeksiyonları geçici bakteriyemi ve diğer yüzeyel enfeksiyonlardan ayırt edilmesinde yararlı bir kriter olduğu sonucuna varıldı. Sağlıklı kişilerde de düşük titrede presipitasyon gözlendiği için, AGD testinde sedecel:4 ve üzerindeki titrelerdeki presipitasyon pozitif olarak değerlendirilmektedir. Endokarditli hasta serumlarının hepsi pozitif bulundu. Kronik osteomiyelitli 6 hastanın 3' ünde, abseli 4 hastanın sadece V inde 1:4 diiusyonda presipitasyon gözlendi. Akut osteomiyelitli 4 hastanın ve geçici bakteriyemisi olan 3 hastanın hiçbirinde pozitif sonuç alınmadı. Sonuç olarak, derin doku yerleşimli stafilokokal enfeksiyonların TA antikorlarının araştırılmasında ELISA' nın duyarlı bir yöntem olduğu ve yaş gruplarına göre standardize edilmiş ticari bir kit ve uygun aralıklarla toplanmış serumlarla, bu tip enfeksiyonların tanısında rutin olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.

45 SUMMARY During last years, new methods such as counter -im in uno electrophoresis (CIE), radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and agar-gel diffusion (AGD) for the serological diagnosis of staphylococcal infections have been developed to detect antibodies against both eztracelluler and cell walls antigens. The serological methods used in this study were ELISA and a commercially available AGD kit (ENDO-STAPH) to detect spesific Ig G antibodies against cell wall antigen teichoic acid (TA) as an aid in clinical diagnosis in Staphylococcus aureus (S. aureus) infections. An ELISA system was developed in our laboratory for the detection of such antibodies in various clinical categories of staphylococcal infections. A highly purified TA prepation was used in ELISA alter treatment of whole bacterial cells with trichloroacetic acid, and then polystyrene microliter plates were coated with a concentration of 4 micrograms/ ml. The ELISA procedure was done with known positive and negative controls. 45 serum samples collected from patients with various types of staphylococcal infections (3 endocarditis, 7 acute osteomyelitis, 15 chronic osteomyelitis, 5 abscess, 3 pneumonia, 3 transient bacteremia, 6 superficial wound infections, and 3 septic artritis) and also serum samples were taken from 10 nasal S. aureus carriers, 6 gram positive infections other than S. aureus and 6 gram negative infections. In addition, 100 serum samples from healthy controls aged 18-63 years and 15 serum samples from healthy children aged 0-15 years to evaluate the age -correlated upper normal limits. All patients were studied with ELISA, but only 20 of patients and only 4 of controls were studied with AGD. Statistical analysis for significance levels (Student t test) was used for the comparison of antibody levels between patients and control groups. Sera from patients with S. aureus endocarditis, and abscess showed significantly higher antibody levels (p< 0.001) when compared with the healthy controls. Also sera from patients with acute osteomyelitis (p<0.01) and chronic osteomyelitis (<0.05) showed antibody levels. There was no cross reaction with46 infections other than S. aureus infections. We conclude that detection of TA antibodies in high titer may differentiate patients with staphylococcal deep- seated infections from those with other forms of staphylococcal infection and transient bacteremia. In AGD test, titers of 1 :4 or more should be considered positive. Ail sera from patients with endocarditis showed high titers. 3 of 6 patients with chronic osteomyelitis were positive (1:4), and only 1 of 4 patients with abscess was found positive at 1:4 dilution. None of the patients with acute osteomyelitis and none of the patients with transient bacteremia showed positive titers. In conclusion, the ELISA was found to be sensitive method for the detection of antibodies against staphylococcal TA. With the establishment of age-correlated normal control values, and especially with adequately spaced samples, the assay can be a useful diagnostic tool for patients with deep-seated infections with bacteremia and with endocarditis of staphylococcal origin.