Piruvatkinazın plasentadan kısmi saflaştırılması ve kinetik özellikleri

Abstract

-62- 6. ÖZET însan plasentasında iki tip piruvat kinaz (E.C.2.7.1.40) bulunduğu ve bunlardan L (veya R) tipinin alyuvar kaynaklı, diğerinin ise plasental kaynaklı olduğu gözlendi. Plasental piruvat kinaz asit kesitlemesi, Sephadex G25 jel eleme ve S-Sepharose iyon değiştirme kromotografisi kullanılarak % 60 verim ve 62 ünite/miligram'lık özgül etkinlikle saflaştınldı. Elde edilen enzim % 50 gliserol (v/v) 5mM 12.5 mM Tris/HCl, pH 7.4 tamponunda -10°C de saklandığında aktivi- te kaybına uğramadığı bulundu. İndirgenmemiş plasental piruvat kinaz değişken substrat olarak PEP ve ADP kullanıldığında Lineweaver-Burk grafiğinde, 1 mM FDP varlığında ve yokluğunda, aşağı kıvrılma gözlendi. Aym en zim eğer -10°C de 282 mM 2-ME ile 4 saat veya 0.5 mM DTT ile 30 dakika inkübe edilecek olursa Lineweaver-Burk grafiğinin Linear hale geldiği gözlendi. İndirgenmiş plasental piruvat kinazın FDP varlığında ve yokluğunda PEP için Km değerleri 0.33-0.50 mM olarak bulundu. İndirgenmiş plasental piruvat kinazın ADP için Km'ini FDP'nin değiş tirmediği (Km= 0.5 mM) gözlendi.

-63- 7. SUMMARY It was observed that there are two types of pyruvate kinase (E.C.2.7.1.40) in human placenta : one of them was the L- (or R) type deriving from erythrocytes the other was the placental type. Placental type pyruvate kinase was purified using acid fractionation, Sephadex G25 gel filtration and S-Sepharose ion exchange chromatography. The yield and the specific activity of the partially purified pyruvate kinase was 60 percent and 62 units per miligram protein, respectively. The purified enzyme was stable when stored at -10°C in 12.5 mM Tris/HCl, pH 7.4 containing 5 mM MgCL2, 0.5 mM EDTA, 5 mM 2-ME, 50 mM (NH4)2S04 and 50 percent glycerol (v/v). The unreduced placental kinase showed downward curvature in Lineweaver-Burk plots for PEP and ADP as the variable substrate in the presence and absence of fructose- 1,6-diphosphate (FDP= 1 mM). When the enzyme incubated with 282 mM 2-ME (at -10°C for 4 hours) of with 0.5 mM DTT (at 37°C for 30 min) the Lineweaver-Burk plots for PEP and ADP as the variable substrate became linear in the presence and absence of FDP (1 mM). When the enzyme reduced as above, the Km values of 0.33 and 0.50 mM for PEP in the presence and absence of FDP, were obtained. The Km of the unreduced placental pyruvate kinase for ADP was not affected by FDP (Km = 0.5 mM for ADP).