Eczacılıkta elektrokimyasal (biyo)sensör tasarımları ve uygulamaları

Abstract

151 ÖZET Tez konusunu oluşturan çalışmalarda, fizyolojik ve patofızyolojik bakımdan oldukça önemli olan nitrik oksit (NO) serbest radikaline duyarlı, polimer kaplı, amperometrik mikroelektrotların tasarımı gerçekleştirildi. Ortam pH 'sının ve sıcaklığının, elektrot yanıtına etkisi ve askorbik asit gibi maddelerin girişim etkileri incelendi. Tasarlanan çalışma elektrodunun yapısını oluşturan teflon kaplı platin mikroteller (%90 platin - %10 iridyum alaşımı, 130 im çaplı) ön temizleme işleminden sonra kullanıldı. Elektrodun optimum pH aralığı pH 3 - 5 'dir. Tayin sınırı, 15 nM (S/N = 3) olup, 0 - 1 (j.M derişim aralığında elektrot yanıtı doğrusaldır. Artan ortam sıcaklığı elektrot yanıtını artırmaktadır; 5x1 0`4 M NO için 25°C de elde edilen yanıt (n=6, CV=%8,10), 40°C 'dekinden 2,35 kat küçük, 10°C 'dekinden 2,00 kat büyüktür. Askorbik asit (10`2M), ürik asit (10`2M), glukoz (10`2M) gibi fizyolojik maddelerin, girişim etkisi, mikroelektrot yüzeyine daldırma yöntemiyle (dip-coating) kaplanan Nafion® ve elektropolimerizasyon ile kaplanan poli(o-fenilendiamin) polimerleriyle giderilmiştir. Vlll-B grubu geçiş elementi metallerinden rodyum' un (Rh), NO analizindeki elektrokatalitik etkisi, polimersiz platin/iridyum mikroelektroduyla incelendi. Rh kaplanan elektrodun yanıtı, 0 - 5 x 10`4 M NO derişimi aralığında doğrusal olup, %varyasyon katsayısı (n=4) %3,91 hesaplandı. Rh kaplanmamış elektrot ise, 2 x 10`4 M NO derişiminden sonra doğrusallığını yitirdi ve %varyasyon katsayısı (n=4) %63,21 hesaplandı. Rh 'un sağladığı elektrokataliz sayesinde, +0,55 V 'da ölçülen askorbik asit yanıtı, +0,80 V 'dakine oranla %61,95 (n=6) küçüldüğü görüldü. NO yanıtındaki azalma ise %13,40 (n=6) oranında gözlendi. Tavşan izole karotid arter endotellerinde asetilkolin (Ach) enjeksiyonlarıyla salınan NO 'nun ölçümü iki farklı yöntemle yapıldı. Bunun için hem tasarlanan mikroelektrodun kullanıldığı elektrokimyasal yöntem (Ag/AgCI 'e karşı +0,80 V 'da), hem de termostatik organ banyolarında gerçekleştirilen kuvvet ölçümü yöntemi kullanıldı. İki farklı yöntemle elde edilen NO değerleri karşılaştırıldı. Her iki yöntemle yapılan ölçümlerin (n=5) sonuçlarında eğilim bakımından paralellik mevcuttur. Ölçümler sırasında en fazla NO salınımı 3x1 0`6 M Ach derişimi152 civarında gözlendi, devam eden enjeksiyonlar sonucunda arterin tekrar kasılmaya başladığı ve NO salınımının durduğu görüldü. Tasarlanan mikroelektrotla, 5-aminolevulinik asit 'e dayalı fotodinamik terapi sırasında fare beyinciği 'nde oluşan NO 'nun in vivo amperometrik ölçümü, +0,80 V 'da (Ag/AgCI 'e karşı) yapıldı. Karanlıkta bekleme süresinden sonra 150 W fiber optik kaynaklı ışığın uygulanması sırasında oluşan NO, 5 dk. süreyle izlendi ve oluşumun 1-1.5 dk. civarında maksimum değere ulaştıktan sonra hızla azalma eğilimi gösterdiği ve yaklaşık 3. dk. sonunda ise sonlandığı gözlendi. NO ölçümü n=6 kez tekrarlandiğında, aritmatik orta değer olan 41,0 nA, kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplandığında, NO derişimi olarak 0,5243 /ıM 'a eşdeğerdir. Tekrarlanabildiğin bir ölçüsü olarak %varyasyon katsayısı %14,72 hesaplandı. NO 'in glukoz oksidaz (GOD), ksantin oksidaz (XOD), polifenol oksidaz (PPO) ve peroksidaz (HRP) enzimleri üzerindeki inhibisyon etkisi elektrokimyasal olarak gösterildi. Bu amaçla elde edilen bulgulardan Michaelis-Menten sabiteleri (Km) hesaplandı. Buna göre Km değeri, GOD için 1,6806, PPO için 0,9104, HRP için 0,7964, XOD için 0,4168 bulundu. Elde edilen Km değerlerine göre, NO inhibisyonundan etkilenme, sırasıyla XOD > HRP > PPO > GOD şeklinde gerçekleşmiştir.

153 SUMMARY As the subject of the thesis, the design of polymer-coated, amperometric microelectrodes has been accomplished for the physiologically and pathophysiological^ important free radical; NO. Effect of pH and temperature on the electrode response and interferring effects of some physiological compounds such as ascorbic acid, have been investigated. Teflon-coated platinum microwires (90% platinum-10% iridium alloy, total diameter 130 (j.m), as the the material of the designed working electrodes, have gone under pre-treatment process before use. Optimum pH range for the electrodes is pH 3-5. Limit of detection is 15 nM (S/N=3) and the electrode response, in the concentration range 0-1 nM, is linear. Electrode response rises as the temperature rises; the response for 5X1 O`4 M NO at 25°C (n=6, CV=8.10%) is 2.35 times smaller than the one at 40°C and 2.00 times bigger than the one at 10°C. Interferring effects of ascorbic acid (10`2M), uric acid (10`2M), glucose (10`2M) have been eliminated by dip-coated Nafion®and electropolymerized o-phenylenediamine polymers on to the surface of the microelectrode. The electrocatalytic effect of the transition metal, rhodium, on NO detection, has been investigated with platinum/iridium microelectrode without polymer coatings. Response of Rh coated electrode is linear in the range, 0-5x1 0`4 M with a %CV of 3,91% (n=4). Electrode without Rh coating, departs from linearity at 2x1 0`4 M with a %CV of 63.21% (n=4). With the help of electrocatalysis provided by Rh, ascorbic acid response of +0.55 V is 61.95% (n=6) of +0.80 V, whereas the decrease in NO response is 13.40% (n=6). Detection of acetylcholine (Ach)-induced release of NO, in rabit isolated carotid artery endotheliums, has been done by two different methods. To do this both the electrochemical method, using the designed microelectrode(at 0.80 V vs. Ag/AgCI), and contractile force measurement method, in thermostatic organ baths, have been used. NO results of the two methods (n=5) have been compared. Measurements of the two methods have results of parallel trends. During measurements, the maximum NO release observed for 3X1 0`6 M Ach,154 with continuing injections artery begab to re-contract and the NO release stopped. In vivo amperometric detection of NO in rat cerebellum during 5-aminolevulinic acid induced photodynamic therapy has been performed via designed microelectrode. After the rest perion in dark, the formation of NO, with the application of 150 W fiber optic ligth source, has been monitored for 5 minutes. NO formation reached a maxima at around 1-1.5 minutes and then a sharp decrease followed by the stopping of NO release at around 3rd minute was observed. NO measurements have been repeated n=6 times, mean current value; 41.0 nA is equivalent to 0.5243 jiM when calculated from the calibration plot. Coefficient of varition (%CV) of reproducibility is calculated as 14.72%. Inhibition effect of NO on glucose oxidase (GOD), xanthine oxidase (XOD), poyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (HRP) has been investigated electrochemically. Using this effect, electrochemical NO-inhibition biosensors have been designed. Michaelis-Menten constants (Km) have been determined using obtained results. Km values for GOD, PPO, HRP and XOD are, 1.6806, 0.9104, 0.7964 and 0.4168 respectively. According to the determined Km values, sensitivity to NO inhibition was as, XOD > HRP > PPO > GOD.