Sağlıklı ve mycobacterium tuberculosis ile infekte bireylerde makrofajların nitrik oksit sentezleme yeteneklerinin biyoesey yöntemi ile belirlenmesi

Abstract

-144- VI. Ö Z E T Bu çalışmada, (1) makrofa] hücre kültürlerinde açığa çıkan NO miktarlarının, kolorimetrik olarak diazotizasyon ve izole kobay aortasında biyoesey yöntemlerinin kullanılmasıyla indirekt olarak belirlenmesi; (2) ölçülen NO miktarları bakımından bu yöntemler arasında karşılaştırma yapılması ve (3) aktif pulmoner tüberkülozlu hastaların kanlarından izole edilen monosit/makrofajların NO sentezleme yetenek lerinin, sağlıklı bireylerinki ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Diazotizasyon çalışmalarında (1) insan monosit/makrofaj kültürlerinin LPS ile uyarımdan sonra nitrit oluşumu bakımından 4 günden fazla süreyle izlenmesiyle kontrole göre anlamlı miktarlarda nitrit düzeyleri elde edilebilir; (2) LPS (25 ng/200 Iil) ile hücreler uyarıldığında anlamlı miktarlarda nitrit düzeyleri elde edilebilmektedir; (3) nitrit miktarları kültür süresince belli bir güne dek artmakta, daha sonra azalmak tadır; (4) nitrit miktarlarının maksimuma ulaştığı günler, bireyden bireye farklılık göstermektedir; (5) insanlar, monosit/makrofajları nitrit oluşturma yetenekleri bakımından, 10 ^M'dan daha düşük nitrit oluşturucular ve 10 nM'dan daha fazla nitrit oluşturucular olmak üzere iki gruba ayrılabilirler, (6) tüberkülozlu deneklerde görülen nitrit oluşumu sağlıklı deneklere göre daha azdır, (7) gerek sağlıklı gerekse tüberkülozlu deneklerde nitrit oluşumu L-NAME ile azaltıiabilmektedir. Biyoesey çalışmalarında (8) izole endotelsizleştirilmiş kobay aortası kul lanılarak, monosit/makrofajlardan sentezlenip salınan nitrit ve/veya nitrit-benzeri madde miktarları belirlenebilir, (9) kültür süpernatantlarıyla elde edilen gevşeme-145- yanıtlarından nitrit ve/veya nitrit-benzeri maddeler sorumlu gibi görünmektedir; (10) tüberkülozlu deneklerde, sağlıklılara göre daha fazla gevşeme yanıtları ve nitrit ve/veya nitrit-benzeri gevşetici madde miktarları elde edilebilmektedir; (11) sağlıklı deneklerde daha düşük nitrit miktarları elde edilmesinin nedeni, LPS uyarımı sonu cunda makrofajlardan salınan kastına maddelerin, geveşetici maddelerin etkisini baskılaması olabilir; (12) tüberkülozlularda daha fazla nitrit miktarları elde edilmesinin nedeni ise, NO-benzeri gevşetici aktivite gösteren maddeler ve sik- looksijenaz metabolitleri olabilir. Her iki tayin yönteminin sonuçlarına göre (13) diazotizasyon ve biyoesey yöntemleri, monosit/makrofajlardan nitrit oluşumunun gösterilmesi için kullanılabilir; (14) NO-benzeri aktivite ölçümü bakımından diazotizasyon yönteminin daha duyarlı olmasına karşın, biyoesey yönteminde daha fazla miktarlar ölçülebilir; (15) bu nedenle, gevşeme yanıtları temel alındığında, biyoesey yöntemi ile daha fazla nitrit miktarları elde edilebilir; (16) biyoesey sisteminin sadece nitrit oluşumunun ölçülmesi bakımından kullanılabilirliği, kültür sırasında ortama ve/veya organ ban yosuna nitrit-benzeri gevşetici etki gösterebilecek maddelerin (arakidonik asit ürün leri gibi) inhibitörlerinin konulması ile spesifiye edilebilir.

-146- VII. SUMMARY In the present investigations, it was aimed that (1) indirect measurement of NO production by human cultured monocytes/macrophages stimulated with LPS by using two independent methods: a colorimetric measurement of the reaction of NO with Griess reagent and a bioassay for NO-mediated relaxation of preconstricted rings of guinea pig aorta; (2) to compare the nitrite amounts by the above men tioned methods and (3) to compare the ability of macrophage NO synthesis from healthy and active pulmonary tuberculous patients. In the diazotization studies it was concluded that (1) nitrite production can be observed up to four days for obtaining significant levels of nitrite; (2) LPS (25 ng/200 ^-induced cell stimulation caused significant levels of nitrite; (3) nitrite con centrations in the culture supematants gradually reached the peak levels at desig nated days following then to decrease; (4) nitrite production was reached a maxi mum at different time-points suggesting that this production was heterogeneous from donor to donor; (5) human monocytes can be classified into two different populations: a low nitrite-producing (< 10 M) and a high nitrite-producing (> 10 M) one; (6) in the tuberculous donors, nitrite production was observed but this produc tion was lower than the healthy donors and (7) L-NAME decreased the NO produc tion by macrophages isolated from healthy and tuberculous donors. In the bioassay studies it was concluded that (8) norepinephrine precon stricted deendothelised guinea-pig aorta ring can be used for the determination of-147- nitrite-like substances released from monocyte/macrophages; (9) these substances seems likely to be responsible for the relaxations obtained with supematants; (10) the reason of the increased nitrite levels obtained from tubereculous patients is that the supematants have nitrite like-activity and/or a nitrite-like relaxing activity in duced by other substances both elaborate relaxation with a masked effect on va soactive substances being found at the same time. As a result, substances having nitrite and/or nitrite-like relaxant activity ob tained from cultured human monocyte/macrophages are detectable by the diazoti- zation and the bioassay methods but the latter method is more sensitive than the diazotization method. In measuring the NO production sensitivity of the bioassay method can be specified by using inhibitors of nitrite-like relaxing factors during culture period and/or in the organ bath.