İnsan endotel hücre kültüründe glibenklamidin etkileri

Abstract

ÖZET GİRİŞ: Katp kanallarının hücre fizyolojisinde ve patofizyolojisinde önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Bu kanalların endotel hücrelerinde de eksprese edildiği kısa bir süre önce bulunmuş ancak Katp kanal blokörlerinin endotel hücreleri üzerindeki in vitro etkileri henüz incelenmemiştir. Bu çalışmada klasik bir Katp kanal blokörü olan glibenklamid'in insan umbilikal ven endotel hücre kültüründe (Human Umbilical Vein Endothelial cell; HUVEC); hücre canlılığı ve süperoksit oluşumu üzerindeki etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. METOD: Endotel hücreleri, insan göbek kordonundan izole edildi ve kültürü yapıldı. Elde edilen hücreler (HUVEC) morfolojik olarak ve immünhistokimyasal olarak von Willebrand faktör varlığı gösterilerek karakterize edildi. Hücre canlılığı total protein miktar tayini yapılarak ve nötral kırmızısı uptake yöntemi ile test edildi. Süperoksit radikali oluşumu `SOD'la inhibe edilen ferrisitökrom C indirgenmesi` yöntemi ile incelendi. Deneyler %2 buzağı serumu içeren M199 besiyerinde tutulan HUVEC ile gerçekleştirildi. SONUÇLAR: HUVEC'e 1CT4 M glibenklamid uygulanması hücre canlılığını zamana bağımlı bir şekilde azalttı. Glibenklamid ile kısa süreli (0.5-1 saat) inkübasyon herhangi bir etkiye neden olmazken, uzun süreli (4-16 saat) inkübasyonun endotel hücre canlılığını önemli ölçüde azalttığı belirlendi (P<0.01). Glibenklamid 10`5 M konsantrasyonda uygulandığında endotel hücre canlılığında herhangi bir azalma oluşturmadı. Bu durum, serum proteinlerine yüksek oranda bağlanmanın serbest glibenklamid miktarlarını, azalttığını ve ortamda kalan serbest ilaç konsantrasyonunun da HUVEC'de Katp kanallarını bloke etmeye yetmediğini düşündürmektedir.,128 Paralel sürdürülen deneylerde, 10`4 M glibenklamid kontrole kıyasla süperoksit oluşumunu önemli ölçüde artırdı (sırasıyla 1.199 ± 0.38 ve 0.669 ± 0.34 nmol/kuyu/45 dakika, p<0.01 ). 250 nM askorbik asit ön uygulaması glibenklamidin HUVEC'de neden olduğu hücre canlılığındaki azalmayı kısmen önledi, inkübasyon süresinin uzatılması bu koruyucu etkinin artmasını sağladı. Bu bulgular askorbik asidin HUVEC'de nitrik oksit üretimini artırdığı yönündeki daha önce bildirilen raporlarla uyumludur. Bu bilgiler ışığında, çalışmamızda askorbik asit ile gözlemlenen koruyucu etkinin de nitrik oksitten kaynaklanması olasıdır. YORUM: Bu çalışmada glibenklamid'in HUVEC hücre canlılığında azalmaya neden olduğu ve bu etkinin süperoksit radikal miktarındaki artışla ilişkili olduğu ilk kez tarafımızdan gösterilmiştir. Literatürdeki veriler ışığında, söz konusu etkilerin, glibenklamid'in HUVEC'de KATP kanallarını bloke etmesine ve membran depolarizasyonuna bağlı gelişebileceği düşünülmektedir

SUMMARY INTRODUCTION: It has been shown that Katp channels have important roles in cell physiology and pathophysiology and their expression in endothelial cells have recently been reported (Katnik C. et al, Am.J.Physiol.1997), The in vitro effects of Katp channel blockers on endothelial cells have not been investigated. In this study, we aimed to study the effects of a classical Katp blocker, glibenclamide on the superoxide formation and viability of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). METHODS: Endothelial cells were isolated from human umbilical veins and cultured. HUVEC characterized morphologically and immunohistoche-mically by demonstration of von Willebrand factor expression. Cell viability was tested by neutral red uptake and measurement of total protein. Superoxide radical formation was followed by `SOD inhibitable ferricytochrome C reduction` assay. Experiments were done on HUVEC grown in M199 with 2% FCS. RESULTS: Treatment of HUVEC with 10`4 M glibenclamide resulted in decreased cell viability in a time dependent manner. Short incubation periods of glibenclamide had no effect, whereas 4-1 6 hours incubation with this drug induced significant decrease in endothelial cell death as measured by neutral red uptake (p<0.01 relative to control). A 10`5 M concentration of glibenclamide did not produce the same effect, indicating that binding to serum proteins decreased free drug availability and this concentration could not block the Katp channels of HUVEC.130 In parallel experiments, 10`4 M glibenclamide induced an increase in superoxide radical formation by the cells compared to control (1.199 ± 0.38 vs 0.669 ± 0.34 nmol/well/45 minutes, p<0.01). It was shown that decreased viability of HUVEC resulting from treatment with glibenclamide could be partially prevented by pretreatment with 250 p.M ascorbic acid. This protective effect increased with time and these findings can be attributed to ascorbic acid induced increases in NO production in these cells, which has been reported in the literature. CONCLUSION: In this study, we report a novel negatif effect of glibenclamide on HUVEC viability, mediated through an increase in superoxide radical formation. Regarding the literature data these effects may be developed through Katp channel blockade and membrane depolarization