Yeni sentetik nosiseptin peptid analogları üzerinde reseptör bağlanma ve fonksiyonel biyokimyasal çalışmalar

Abstract

ÖZET 'Reverse farmakoloji' yaklaşımını kullanarak 1994'te bir orfan (öksüz) G-proteiniyle kenetlenmiş reseptör (GPCR) proteininin cDNA'sı değişik türlerden klonlamıştır. Opioid reseptörlerde bulunan dizilişe homolojik olması nedeniyle 'Opioid Reseptör Benzeri' (Opioid Receptor-Like, ORLl) olarak isimlendirilmiştir. cDNA klonlanmasmı takiben ORLl reseptörünün endojen ligandı olan 'Nosiseptin/Orfanin FQ' keşfedilmiştir. Bu yeni heptadekapeptid opioid peptidlerden özellikle Dinorfin A'ya bazı yapısal benzerlikler göstermesine rağmen fonksiyonel olarak değişik özelliklere sahiptir. Nosiseptinin opioid reseptörlerin hiçbirine belirgin bir afinitesi yoktur ve nosiseptinle yönlendirilen fizyolojik etkiler yaygın opioid antagonisti nalokson tarafından geri çevrilemez. ORLl reseptör proteini ve nosiseptin nöropeptidinin santral sinir sistemindeki (SSS) geniş yayılış ve ekspresyonundan dolayı bu reseptör-ligand sistemi pek çok biyolojik olayın gelişiminden sorumludur. Nosiseptin daha çok ağrı mekanizmalarını ayarlamada (supraspinal olarak anti-analjezik, spinal olarak analjezik etkiler), SSS'nin arabulucuk ettiği davranışlarla yani endişe, stres, öğrenme, hafıza, tolerans, bağımlılık beslenme, suistimal edilen ilaçların ödüllendirme ve pekiştirici özellikleriyle ilişkilidir. Ayrıca nosiseptinin kardiyovasküler sistem üzerinde de etkileri vardır.51 Nosiseptin reseptör-ligand sisteminin hücresel ve moleküler mekanizmaları, agonist ve antagonist özellikteki yeni ligandların tanımlanması ile daha ileri karakterize edilebilir. Bugüne kadar çeşitli peptid ve non-peptid nosiseptin antagonistlerinin yanısıra agonistleri de geliştirilmiştir. Bu çalışmada radyoligand bağlama deneylerinin yapılabilmesi için yeterli spesifik aktiviteye sahip iki yeni, stabil ve etkili nosiseptin radyoligandı karakterize edildi. Bu yeni radyoligandlar 3HJTyr^Nociceptin-OH (40 Ci/mmol), [3H]Nociceptin(l-13)NH2 (30 Ci/mmol)'dır. Yeni, güçlü ve selektif antagonistler tanımlamak ve ayrıca yapı-etki ilişkilerini daha iyi anlayabilmek amacıyla sıçan beyin dokusu membranlarında, yeni radyoligandlar ve doğal amino asit dizilişi gösteren [3H]Nociceptin-NH2 (24.5 Ci/mmol) ile yarışma bağlanma deneyleri yaptık. G-protein aktivasyonunu gösteren fonkiyonel biyokimyasal deneyler ise yine aynı doku örneklerinde [35S]GTPyS (1204 Ci/mmol) ile yapıldı. Yapılan deneylerde, 'Combinatorial Chemical Library' de bulunan asetillenmiş bir peptidin (AC-RYYRIK-NH2) yapısına dayanarak sentezlenen yeni modifiye heksapeptidler radyoligand bağlama deneyleriyle incelenmiştir. İncelenen bu heksapeptidler arasında Ac-RYYRIK-ol [3H]Tyr'-Nociceptin-OH ile yer değiştirmede yüksek afînite (EC5o=3.9±2.6nM) göstermiştir. ^HJTyr'-Nociceptin-OH ile yarışmada yeni geliştirilen heksapeptidler afinitelerinin derecelerine göre şu şekilde sıralanmışlardır: Ac-RYYRIK-ol > ClAc-RYYRIK-ol > Ac-RYYRIK-NH2 > >Bz-RYYRIK-ol > Ac-RYY-Cit-IK-NH2 > Piv-RYYRIK-ol > Ac-RYY-Cit-IK-ol > For-RYYRIK-ol > Ms-RYYRIK-ol > H-RYYRIK-ol. GTPyS bağlanma deneylerinde bu heksapeptidlerden sadece Ac-RYYRIK-ol çok zayıf, ancak konsantrasyona bağımlı G-protein stimülasyonu göstermiştir. Ayrıca bu stimülasyonun 1 uM Ac-RYYRIK-ol52 ilavesiyle kademeli olarak geriye çevrilmesi veya inhibe edilmesi asetillenmiş heksapeptid alkolünün antagonist karakterini işaret etmektedir. Nosiseptin analoglarının GTPyS bağlanma deneylerindeki stimülasyonlarının 1 uM nalokson ile inhibe edilememesi nosiseptin-ORLl reseptör sisteminin opioid sisteminden farklı bir sistem olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak; yeni geliştirilen nosiseptin radyoligandlan ve yeni sentetik heksapeptidler, nosiseptin-ORLl reseptör sisteminin daha ileri incelemelerinde kullanılabilecek yararlı araştırma araçları olarak işlev gösterebilirler. Heksapeptid alkolü olan Ac-RYYRIK-ol, potansiyel yeni nosiseptin antagonisti olarak önerilebilir. Bileşiğin peptid yapısından dolayı terapötik kullanımı sınırlı olmasına rağmen, bu bileşik nosiseptin reseptör ligandlarında yapısal gereklilik, nosiseptin reseptörü ile etkileşme biçimleri, aktivasyon mekanizmalarını anlayabilmek için yapılacak deneylerde değerli bilgi ve deneysel veriye ulaşmak için iyi bir araç olacaktır.

SUMMARY By using reverse pharmacology approach, in 1994 the cDNA of an orphan G-protein coupled receptor protein was cloned from different species. This receptor was called 'Opioid Receptor-Like' (ORL1), because of the substantial sequence homologies with opioid receptors. One year later the endogenous ligand for the ORL1 receptor, named 'Nociceptin/Orphanin FQ' was discovered. Although this new heptadecapeptide shares some structural similarities mostly to the opioid peptide Dynorphin A, they have different functional properties. Nociceptin has no significant affinity for any of the opioid receptors and nociceptin-mediated physiological effects can not be reversed by the most common opioid antagonist, naloxone. Because of the wide distribution and expression of ORL1 receptor protein and nociceptin neuropeptide in the central nervous system (CNS), this receptor-peptide system is responsible for a number of biological actions. Nociceptin is involved mostly in modulating pain mechanisms (anti-analgesic actions supraspinally and analgesic actions spinally), in CNS mediated behaviours like anxiety, stress, learning, memory, tolerance, dependence, feeding, also in rewarding and reinforcing properties of drugs of abuse. Nociceptin also has effects on the cardiovascular system.54 Cellular and molecular mechanisms of the nociceptin receptor-ligand system can be characterized further by identifying new ligands with agonist and antagonist property. Until now several peptide and non-peptide nociceptin antagonists as well as agonists were developed and reported. In this study we have characterized two new stable and effective nociceptin radioligands with enough specific activities to perform radioligand-binding experiments. These new radioprobes are [^FfJTyr'-Nociceptin-OH (40 Ci/mmol), [3H]Nociceptin(l-13)NH2 (30 Ci/mmol). To determine new, powerful and selective antagonists and to understand more about structure-activity relations we have performed competition binding assays with the new radioligands and with [3H]Nociceptin-NH2 (24.5 Ci/mmol) which exhibits the full-size natural amino acid sequence. Functional biochemical assays indicating G-protein activation with [35S]GTPyS (1204 Ci/mmol) were also carried out by using rat brain membranes. New modified hexapeptides with structures based on an acetylated peptide (AC-RYYRIK-NH2) found in combinatorial chemical library were synthesized and examined by radioligand binding assays. Among these hexapeptides Ac-RYYRIK-ol displaced [3H]Tyr-Nociceptin-OH with high affinity (EC50=3.9±2.6 nM). The rank order of affinities of these newly developed hexapeptides for displacing [3H]Tyr-Nociceptin-OH are: Ac-RYYRIK-ol > ClAc-RYYRIK-ol > Ac-RYYRIK-NH2 > >Bz-RYYRIK-ol > Ac-RYY-Cit-IK-NH2 > Piv-RYYRIK-ol > Ac-RYY-Cit-IK-ol > For-RYYRIK-ol > Ms-RYYRIK-ol > H-RYYRIK-ol. Among these hexapeptides Ac-RYYRIK-ol displayed only very weak, but concentration dependent stimulation of G-proteins in GTPyS binding assays. Also this stimulation was gradually reversed or inhibited by adding 1 uM of Ac-RYYRIK-ol, indicating the antagonist character of this55 acetylated hexapeptide alcohol. Stimulation of nociceptin analogs was not inhibited by 1 pM opioid receptor antagonist naloxone, indicating that nociceptin/ORLl system is different than the opioid system. As a conclusion, both the newly developed nociceptin radioligands and the novel synthetic hexapeptides can function as useful research tools for further investigation of the ORL1 -nociceptin receptor system. The hexapeptide alcohol can also be suggested as a potential nociceptin antagonist. Therapeutic usage of this hexapeptide is limited because of the peptide structure, yet this compound can provide valuable information and experimental data to understand structural requirements for the ligands, mode of interactions and mechanisms of activation of the nociceptin receptor.