İnsan serumlarında difteri antitoksin düzeyinin kantitatif bioassay yöntem ile ölçülmesi

Abstract

Difteri toksini tek bir polipeptid zinciri olarak salgılanır. 'A' ve '5*' zinciri olmak üzere iki zincire sahiptir. 'A` zinciri toksinin enzirnatik kısmını içerirken *B' zinciri toksinin bağlanma bölgesini içerir. Difteri toksini ökaryotik hücrelerde protein sentezini inhibe ederek etki gösterir. Difteri toksininin `A` fragmanı ökaryotik hücrelerde bir enzim gibi hareket ederek NAD+ ve zincir uzatma faktörü EF-2 arasında inaktif bir ADP-Riboz-EF-2 kompleksi oluşturmakta ve bu olay translokasyonu engelleyerek hücrelerde protein sentezini inhibe etmektedir.Günürnüzde difteri toksini aşı üretiminde ve standardı' zasyonunda kullanılmaktadır. Bu amaçla kullanılan yöntemlerden bir tanesi de in vitro nötralizasyon testidir. Bu test, kültür ortamındaki Vero hücrelerinin metabolik akt i vitesinin difteri toksini nce inhibe edilmesine ve serurnl ardaki antitoksinin toksin etkisini nötralize etmesi olayına day a n m a k t a d ı r. Biz araştırmamızda in vitro nötralizasyon yöntemini 2-5 yaş arasındaki aşılı 6 çocuğun serurnl arı ndaki antitoksin miktarına göre canlı hücre miktarını MTT maddesi kullanarak spektrofotometrik sonuçlar yardımı ile saptamaya çalıştık.Âraştırmamızın ilk basamağında, kullandığımız toksinin minimum sitotoksik dozunu bulmaya çalıştık. Birinci aşamada toksinin &100 öldürme dozunu 4 x 10~4 Lf/ml. olarak saptadık. İkinci aşamada ise £100 öldürme dozuhdaki toksini nötralize eden standart antitoksin düzeyi bulundu. Kullandığımız antitoksinin düzeyi 0.00976525 lU/ml. olarak saptandı. Üçüncü aşamada ise, 2-5 yaşları arasında bulunan 6 aşılı çocuğun serumlarındaki antitoksin düzeyleri saptandı. Buna göre, örneklerin antitoksin düzeyleri sırası ile 1.28, 2.56, 0.32, 2.56, 0.16, 0.16 lU/ml. olarak saptandı.

Diphtheria toxin is secreted as a single peptide and then cleaved to an A chain and B chain. The A chain contains the enzymatic site and the 6 chain contains the translocation and binding sites of the toxin. Diphtheria toxin expresses its toxicity by inhibiting eukaryotic cellular protein synthesis. The inhibition results from inactivation of a cytoplasmic enzyme required for protein synthesis, elongation factor 2. The A chain of diphtheria toxin is a transferase which links the ADP-ribose portion of NAD+ to elongation factor 2, ADP-ribosylated elongation factor 2 is inactivate at protein synthesis.Nowadays, diphtheria toxin is used in vaccine production and standardisation. In this event, one of the method that is used isin vitro neutralization test. This test depends on neutralizing the toxin's effect on Vero cells by using serum that contains antitoxin. In our investigation, we used MTT in Vero cell assay which is based on the conversion of the yellow tetrazolium salt to the coloured formazan product by mitochondrial enzymes in viable cells. The concentration of the coloured product can be measured spectrophotometrically and is proportional to the number of viable cells according to the amount of the antitoxin amounts in serum samples.In the first step of our investigation we tried to fix the minimum cytotoxic dose of diphtheria toxin. In this step, we found 100& lethal dose effect of toxin as 4 x 10`4 Lf/ml.. In the second step, we found the amount of antitoxin that Is neutralized the 100£ lethal dose effect of toxin. So, the amount of antitoxin which we used is 0.00976525 lU/rnl. In the third step, we found the amount of antitoxin at the serum samples as 1.28IU/ml., 2.56IU/rnl., 0.32IU/ml., 2.56IU/ml., 0.16IU/ml., 0.16IU/rnl. in order.