Farklı yöntemlerle polimerize edilen bazı akrilik rezinlerin biolojik uyumlarının in vitro incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada ısı (konvansiyonel), kimyasal ve mikrodalga enerjisi ile polimerize olan dört farklı protez kaide rezinin önce hücre inokulasyonu ile monomerlerinin in vitro sitotoksisitesi araştınldı.Daha sonra polimerize edilmiş dört farklı protez kaide rezinin sitotoksisitesi, agar overlay, millipore filtre ve 3H-Thymidine kullanım hücre kültürü test yöntemleri ile değerlendirildi. Operatif olarak steril şartlarda alınan gingiva dokusundan üretilen Primer İnsan Gingival Fibroblast (İGF) hücre kültürleri hücre inokulasyonu, agar overlay ve millipore filtre testinde kullanılmak üzere hazırlandı. Protez kaide rezinlerinin monomerlerinin hücre kültürü üzerindeki toksik etkileri ISO standartları No: 7405'e uygun olarak her numuneden hazırlanan farklı sulandırmalara ait inokülasyonlardan sonra izlendi. Bu amaçla hücre kültürü vasatı içinde 1/10'dan başlamak üzere, 10'ar katlı 8 basamak sulandırmalar hazırlandı. Elde edilen numuneler inokülasyon öncesi 0,45 nm por büyüklüğüne sahip millipore filtreden süzülerek sterilize edildi. Hazırlanan süzüntüler daha önce İGF hücre kültürü üretilmiş 24 gözlü makrotabletlere inoküle edildi. Bu amaçla her numune için bir adet tablet kullanıldı. Her monomere art hazırlanmış olan 6 basamak sulandırmadan dört adet tablet gözündeki hücre kültürü vasatı içine 100 (J hacimde inokule edildi. Değerlendirmeler inokulasyonu izleyen 3, 6, 12, 18 ve 24. saatlerde mikroskop kontrolleri ile yapıldı. ISO standartları No: 7405'e uygun olarak farklı yöntemlerle polimerize edilmiş protez kaide rezin disklerin sitotoksisitesi in vitro agar overlay test yöntemi ile araştırıldı. Bu amaçla 100 mm çaplı petri kutularına 1,5 x 105 hücre/ml olacak şekilde % 10 FDS içeren DMEM içinde sulandırılan İGF hücrelerinden 15 mi hacimde konuldu. 37°C 'de %5 CO2 içeren etüvlerde inkubasyona bırakıldı.Eklenen agar vasatı üzerine, her petri kutusuna ikişer adet olmak üzere örnek disklerle birlikte pozitif ve negatif kontrol örnekleri62 yerleştirildi. Hücresel toksisitenin izlenebilmesi için dört gün süre ile mikroskobik ve makroskobik kontrolleri yapıldı. Süre sonunda toksik etkiler zon ve hücre erime indekslerine göre tesbrt edildi. Bulguların doğrulanması için agar tabakası uzaklaştırılan hücreler giemza ile boyanarak mikroskopta ( Inverted tissue culture microscope) incelendi. Hücre bazında toksisite belirtileri arandı. Agar overlay testinde dört gün süre ile kontrol edilen polimerize edilmiş protez kaide rezin disk örneklerinin hiç birinde toksisik bulgu saptanamadı. Pozitif kontrol olarak kullanılan 1M amonyum molibdat çözeltisi emdirilmiş kurutma kağıdına ait bölgedeki hücrelerde ise %100 oranında toksik etki bulunmuştur. ISO standartları No: 7405 'e uygun olarak millipore filtreden yayılım test yöntemi ile farklı yöntemlerle polimerize edilmiş protez kaide rezin disklerinin sitotoksisitesi in vitro olarak araştırıldı Test için 60 mm çaplı plastik petri kutularına %10 FDS içeren DMEM için 1,5 x1 05 hücre/ml olacak şekilde hazırlanmış İGF hücrelerinden 6 mi hacimde konuldu ve %5 CO2 etüvde 24 saat süreyle inkübasyona bırakıldı.Otoklavda steril edilen 0,60 nm por büyüklüğüne sahip selüloz asetat membran filtreler ıslatılmış oldukları medium içinden alınarak petri kutuları içinde üretilmiş olan hücrelerin yüzeyine yerleştirildi. Her test numunesi için altı petri kutusu kullanmak şartı ile standart büyüklükteki test örneklerinden membran filtreler üzerine düzenli olarak yerleştirildi. İleri inkübasyon için sistem % 5 CO2 içeren 37°C 'lik ortama bırakıldı. Numunelerle ilgili toksisite kontrolleri inokülasyonu izleyen 6, 12, 24, 36, 48 ve 72. saatlerde test sistemlerindeki membranlar uzaklaştırılarak hücrelerin mikroskopta incelenmesiyle gerçekleştirildi. Ayrıca test sırasında kullanılan membran filtrelerle ilgili toksisite kontrolleri yapıldı.72 saat süren kontrolleri sonunda numunelere ait petri kutularının hiç birisinde hücresel toksisite bulgusuna rastlanmadı. ^-Thymidine kullanım testi, mikro sistemde ISO standartları No:7405'de bildirilen yöntemde bazı modifikasyonlarla gerçekleştirildi. Mikrotablet gözlerine, her tablet gözüne 1 x 10s İGF hücresi düşecek şekilde sulandırılan hücre süspansiyonundan 100 uJ hacimde yerleştirildi. Tablet gözlerine uygun hacimlerde hazırlanmış polimerize olmuş protez kaide rezin disklerinden her hücre konsantrasyonu için altışar adet olacak şekilde örnekler-63 yerleştirildi. Sistem 72 saat süreyle 37°C 'lik % 5 CO2 içeren etüvde inkübe edildi. Süre sonunda tablette kullanılan her göze 0,5 /ı courie dozda ^Thymidine eklenerek,18 saat süreyle inkübasyona devam edildi. Celi harvester'da toplanan hücreler, fiber glas filtre kağıtlarına emdirildikten sonra kurutuldu.6 mi sintilasyon kokteyli (PPO, POPOP, TOLUEN), ile muamele edilen numunelerle ilgili değerler 0 - Counterman cpm olarak kayıt alındı. Bu test sonucunda bulgu kimyasal yolla polimerize olan Takilonun numunelerinde % 53 hücre proliferasyonu,QC-20 konvansiyonei ısı ile polimerize olan numunelerde % 25 mikrodalga ile polimerize olan numunelerde ise % 13 hücre proliferasyonu, ACRON- MC mikrodalga ile polimerize olan numunelerde % 22 hücre inhibisyonu konvansiyonei ısı ile polimerize olan numunelerinde %16 hücre inhibisyonu seklinde gözlendi. En az sitotoksik bulguyu % 7 hücre inhibisyonu ile otopolimerizan akril olan Meliodent verdi.

In this study in vitro cytotoxicity of monomers of four different denture base resins which were polymerized by chemical, head, and microwave energy were analysed by inocculation method. Additionally, the cytotoxicity of these four different polymerized denture base resins were evaluated by means of agar overlay, millipore filter, and 3H- Thymidine incorporation cell culture test methods. Primary human gingival fibroblastic cell cultures obtained from gingival biopsy tissues under sterile conditions were prepared to use in cell inocculation, agar overlay, and millipore filter tests. The toxic effects of monomer on cell culture were observed after inocculations of different dilutions prepared from each specimen in accordance with ISO Technical Report No: 7405. For this reason six-stepped dilutions, which were started from 1/10 and ended at 1/106, were prepared in cell culture medium. Obtained specimens were sterilized by filtering from a millipore filter having a pore size of 0.45 nm before inocculation. Prepared filtrates were inocculated in 24 welled macrotablets in which previously human gingival fibroblast cells were cultured so, a tablet was used for each speciment. Six-stepped dilutions of 100^1 volume prepared from each of the four monomers were inocculated into the cell culture mediums which were placed in four units welled tablets. Evaluations were made on the 3rd, 6th, 12th, 18th, and 24th hours following inocculation procedure by means of microscopic controls. The cytotoxicity of denture base resin discs, which were polymerized by different methods in accordance with ISO Technical Report No: 7405, were studied by means of in vitro agar overlay test method. For this reason, human gingival fibroblasts (1,5 x 10s cell/ml65 per dish) in 15 ml of Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM) supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS) were seeded into the petri dishes having a diameter of 100nm. These petri dishes were incubated four 96 hours at 37° C in 5 % CO2 ? Over the added agar medium, together with the sample dishes positive and negative control samples, two samples were placed into every petri dish. To follow the cellular toxicity, microscopic and macroscopic controls were done for four days. At the end of this period, toxic effects were determined according to the zone and cytolysis indexes. Cells of which agar layer had been removed by the corroboration of the data, were stained with giemza and then examined under an inverted tissue culture microscope. The toxicity symptoms were searched at the cellular level. None of the polymerized denture base resin disc samples, which were controlled for four days in the agar overlay test, showed toxicity symptoms. Proportionally 100 % toxic effect was found in the cells on zone belonging to the blotting paper which has absorbed the 1 M Ammonium molibdate solution used as a positive control. The in vitro cytotoxicity of denture base resin discs which were polymerized with different methods were investigated with millipore filter test method in accordance with ISO Technical Report No: 7405. For the test, human gingival fibroblasts (1,5 x 10s cell/ml per dish) in 6ml of Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM) supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS) were seeded into the plastic petri dishes having a diameter of 60mm.These petri dishes were incubated for 24 hours at 37° C in 5 % CO2 incubator. 0,60 nm pore sized and sterilized (in autoclav) cellulose asetate membran filters are taken from the medium in which they were got wet, and they were settled on the surface of the cells which were produced in petri dishes. Using six petri dishes for every test sample, standart sized test samples were placed on to the membran filters in order. For improved incubation, this system was left in a medium containing 5 % CO2 at 37° C. The toxicity controls related to the samples were materialized with the investigation of cells under microscope after removing the membrans in test systems in the 6th, 12th, 24th, 36m,4&m, and 72nd hours following the inocculation. Moreover, toxicity controls, that were related with the membran66 filters used during test, were done. After a 72 hours lasting period, in none of the petri dishes, containing samples, cellular toxicity symptoms were found. 3H-Thymidine incorporation test was materialized in the micro system using certain modifications for ISOTechnical Report No:7405. In each well of the microtablets a volume of 100jd, 1 x 105 human gingival fibroblast cell containing diluted cell suspansion was placed. Polymerized denture base resin discs, which were prepared in appropriate volume to tablet wells, were placed (six samples) for each cell concentration. This system was incubated for 72 hours at 37° C In 5 % CO2. At the end of this period in each well used in the tablet 0,5m. courie ^Thymidine was added and then it was continued to to incubation for 18 hours. Cells that were collected in the cell harvester, were dried after having been absorbed to the fiber glass filter papers. Values related to specimens treated with 6 ml simulation cocktail (PPO. POPOP, TOLUEN) were recorded in the p-courrter as cpm. At the end of this test, observed findings were as following: 53 % cell proliferation in the chemically polymerized Takilon samples, 25 % cell proliferation in the heat-polymerized QC-20 samples, 13 % cell proliferation in the microwave polymerized QC-20 samples, 22 % cell inhibition in the microwave polymerized ACRON-MC samples, and 16 % cell inhibition in the heat-polymerized ACRON-MC samples. The least cytotoxic finding was obtained from autopolymerized acrylic Meliodent with a result of 7 % cell inhibition.