Tükürük müsinleri MG1 ve MG2`nin izolasyonu ve müsin-bağlanan oral streptococ adezinlerinin tespiti ve tanımlanması

Abstract

170 6.ÖZET Tükürükte, hem yapı hem de fonksiyon olarak farklı iki müsin türü olan MG1 ve MG2 bulunmaktadır. MG1 tükürüğe mukus özelliklerini verirken MG2, mikroorganizmaların ağızdan temizlenmesi için onlarla etkileşmektedir. Bunlar arasında, streptococ türü bakteriler, ağızda baskın olarak bulunması ve diş ve ağız yüzeylerine birincil olarak kolonize olmalarından dolayı ilk sırayı almaktadır. Bu noktadan hareketle, MG2-oral streptococ ilişkisinin anlaşılması, diğer bakterilerle müsinler arasındaki ilişkilerin açığa çıkarılması için model bir mekanizma sunabilmektedir. Bunu ortaya çıkarabilmenin ilk basamağını da, bakteri üzerindeki spesifik bağlanma yerlerinin yani adezinlerin belirlenmesi ve tanımlanması oluşturmaktadır. Bu çalışmada, bakteri-müsin etkileşmesini inceleyebilmek için, bu moleküllerin tükürükten bol ve saf olarak izolasyonuna olanak tanıyan iki aşamalı bir kromatografik saflaştırma işlemi uygulandı. 4M guanidin klorürde (GuHCI) solübülize edilen tükürük önce Sepharose CL- 4B kromatografisine tabi tutuldu. Bu etapta,daha büyük molekül ağırlıklı (2-3 x 106 Da) MG1' den ve daha küçük molekül ağırlıklı (105 Da) proteinlerden ayrı olarak elde edilen yarı-saf MG2 fraksiyonu, ileri saflaştırma için üre içerisinde bir MonoQ iyon-değiştirme kolonunda doğrusal olmayan bir lityum perkolorit gradyanı ile HPLC ye tabi tutuldu. Buradan elde edilen saf MG2 nin molekül ağırlığı 218 kDa olarak171 belirlendi. CL-4B'den elde edilen MG1 fraksiyonu ise iki basamaklı bir dansite gradyan ultrasantrifüj işlemi ile saflaştırıldı. Streptococcus gordonii PK488 ve LGR2' den, SDS ile ekstrakte edilen membran proteinleri, SDS-PAGE ile ayrılıp Western transfer ile membrana aktarıldıktan sonra, MG2, MG1 ve altüniteleri ile katı fazda inkübe edilerek, müsin-bağlanan streptococ adezinleri, immünolojik ve otoradyografik olarak tesbit edildi. S.gordonii LGR2 için MG2-bağlanan adezinler 62,78,84,124 ve 133 kDa proteinler olarak gözlenirken, PK488 için ise 62,78,84,119 ve 133 kda proteinler olarak tespit edildi. PK488 susundan preperatif SDS-PAGE kullanılarak saflaştırılan 62 kDa adezin, tanımlanmasının yapılabilmesi için ileri işlemlere tabi tutuldu. SDS-PAGE elektroforezi ve ardından gümüş boyama ile görüntülenen adezin, jel içerisinde sindirildikten sonra peptitleri ekstrakte edildi. Bu peptitler MALDI-TOF MS' de incelenerek peptit kütle haritası çıkarıldı. Peptit kütle veritabalarından yararlanılarak yapılan bir araştırma, bu proteinin peptit kütlelerinin Streptococcus pyogenes yüzey proteini M 12 (62904.3 Da) ile birinci sırada (% 50) benzerlik gösterdiğini ortaya çıkardı. Diğer taraftan, bu proteinin rp-HPLC ile iki basamakta saflaştırılan 1337 ve 1669 Da peptitlerinin amino asit dizilimleri Edman degradasyonu ile tespit edildi. Protein dizilim veritabanlarından faydalanılarak yapılan bir araştırma, bu peptitlerin dizilimlerinin Streptococcus oralis uzatma faktörü TU (EF-TU 43.986 kDa)' nun172 sindiriminden ortaya çıkan sırasıyla 1336.3 ve 1668.8 Da peptitleriyle % 100 dizilim benzerliği gösterdiğini ortaya çıkardı.

173 7. SUMMARY Salivary mucus contains two major mucin populations namely MG1 and MG2. MG1 provides the Theological properties to saliva while MG2 binds to microorganisms to facilitate their clearance from the oral cavity. MG2 can adhere to various strains of streptococci which are primary colonizers and predominant microorganism of the oral cavity. Hence MG2-streptococci interactions may represent a model mechanism for understanding of the secrets of this interaction within the oral cavity. In order to further investigation of these interactions and their consequences, the specific binding sites on the bacteria in other word adhesins that bind MG2 must be identified. In this study, a rapid two step procedure that recovers this molecule at almost complete purity and that permits the isolation of the molecule in adequate quantity to enable bacterial-MG2 interaction studies was used. The raw saliva was first solubilised in 4M guanidinium chloride (GuHCI) and then subjected to Sepharose CL-4B chromatography in 4M GuHCI. MG2-rich fraction was recovered free from the large MG1 molecules which eluted in the void volume and also extensively free of the smaller proteins below Mr 100,000. This fraction was subjected to ion- exchange chromatography on a Mono Q anion exchange column eluted in 6M urea plus 0.1% CHAPS with a non-linear gradient of lithium174 perchlorate. MG1 was purified by using two steps density-gradient centrifugation. Thereafter, in order to determine mucin-binding adhesins from Streptococcus gordonii PK488 and LGR2, a solid phase assay was applied. Extracted bacterial cell surface proteins were Western blotted and subsequently probed with MG2,MG1 and its subunits. A number of MG2- binding Streptococcal adhesins were detected by immunological procedures. Major bands with apparent Mr 62, 78, 84 124 and 133 kDa were clearly visible with the profile from S.gordonii LGR2 and bands with apparent Mr 62, 78, 84, 119 and 133 were observed with the profiles from S.gordonii PK488. 62 kDa adhesin from the PK488 strain was purified and identified by subsequent in-gel digestion in the SDS-PAGE. Resulting peptides were analyzed with MALDI -TOF MS to obtain the peptide mass fingerprint. A research on the peptide mass databases revealed similarity with Streptococcus pyogenes surface protein M 12 (62904.3 Da) at first rank. On the other hand, the primary sequence of the peptides, purified on the micro reverse phase HPLC, 1337 and 1669 Da were determined by an automated Edman degradation, and a search of the protein sequence databases revealed a %100 sequence homology with 1336.3 and 1668.8 Da peptides respectively resulting from digestion of Streptococcus oralis Elongation factor TU (EF-TU) with Mr 43.986 kDa.