Glokom tedavisinde yeni dozaj şekillerinin tasarlanması ve farmakodinamik cevaplarının değerlendirilmesi

Abstract

G.ÖZET İlaçların gözde kalış süresinin uzatılması biyoyararlarının arttırılmasına yol açmaktadır. Gözde kalış süresinin uzatılması için izlenen yöntemlerden birtanesi de ilaçların mikroemülsiyon şeklinde göze uygulanmasıdır. Bu çalışmada, glokom tedavisinde kullanılan pilokarpin hidroklorür'ün mikroemülsiyon formülasyonu hazırlanmıştır. Mikroemülsiyon formülasyonu, yağ fazı olarak soya yağı, surfaktan ve ko-surfaktan olarak Span 80, Brij 35 P ve 1-Butanol, koruyucu olarak a- tokoferol ve su kullanılarak hazırlandı. Mikroemülsiyon formülasyonun in vitro stabilitesini belirlemek üzere elektriksel iletkenlik, pH, dansite, refraktif indeks, faz ayrışması gibi parametrelerin 12 ay boyunca, damlacık büyüklüğüne vizkozite ölçümlerinin 6 ay boyunca üç farklı sıcaklıkta (4 °C, 25 °C, 40 °C) yapıldı. Bu çalışmalar sonucunda sayılan parametrelerin değişmediği mikroemülsiyonun stabil olduğu belirlendi. Mikroemülsiyonun damlacık büyüklüğünün belirlenmesi için Malvern Zeta Sizer 3000HSa cihazı kullanıldı. Damlacık büyüklüğü ölçüm çalışmalarında hazırlanan mikroemülsiyon formülasyonun dış fazının kırılma indisi (1,446) ile mikroemülsiyon formülasyonun kırılma indisinin (1,443) birbirine çok yakın olması nedeniyle sağlıklı sonuçlar elde edilemedi. Damlacık büyüklüğü ölçümünde kullanılan teknikte, mikroemülsiyonun dağıtan fazı ile mikroemülsiyon formülasyonunun kırılma indislerinin farklı olması ve uygulanan ışığın kırılması gerekmektedir. Hazırlanan mikroemülsiyonda bu koşul yerine getirilemediği için mikroemülsiyon içindeki damlacıkların 134büyüklüğü ölçülemedi. Bu sonuç mikroemülsiyonun göze uygulandığında hastalarda görmede herhangibir bulanıklığa yol açmayacağı sonucunu ortaya koymaktadır. Pilokarpin hidroklorür içeren mikroemülsiyonun stabilite çalışmaları 4 ay boyunca üç farklı sıcaklıkta (4 °C, 25 °C, +40 °C) yapıldı. Pilokarpin hidroklorür miktarı HPLC yöntemi kullanılarak ölçüldü. Üç farklı saklama koşulunda (4 °C, 25 °C, 40 °C) mikroemülsiyon formülasyonu içindeki pilokarpin hidroklorür'ün birinci derece kinetikle bozunduğu tespit edilmiştir. Arhenius eşitliği kullanılarak yapılan hesaplamalar sonucu mikroemülsiyonun raf ömürleri ( t90) sırasıyla, 455, 227 ve 152 gün olarak belirlendi. Difüzyon hücre deneme çalışmalarında, %4 oranında pilokarpin hidroklorür içeren jel, %2 ve %4 oranında pilokarpin hidroklorür içeren mikroemülsiyonların 1 cm2'lik alandan salım hızları karşılaştırıldı. Denemeler 37± 0,1 °C'de, pH 7,4 fosfat tampon çözeltisi kullanılarak yapıldı. Difüzyon hücre deneme çalışmalarında, %4 oranında pilokarpin hidroklorür içeren jel'in, %2 ve %4 oranında pilokarpin hidroklorür içeren mikroemülsiyondan, daha hızlı ve daha fazla pilokarpin hidroklorür saldığı belirlendi. %2 ve %4 oranında pilokarpin hidroklorür içeren mikroemülsiyonlar kendi içlerinde karşılaştırıldığında %4 oranında pilokarpin hidroklorür içeren formülasyonun %2 oranında pilokarpin hidroklorür içeren mikroemülsiyon formülasyonundan yaklaşık olarak 1,5 kat fazla ve hızlı pilokarpin hidroklorür saldığı tespit edildi. 135Difüzyon hücre deneylerinde kullanılan membranlar, göz gibi çok katlı değildir. Göze uygulanan ilaçlar drenajla uzaklaştırılmakta buna karşın difüzyon hücrelerinde donör kompartımanda ilaç sabit kalmaktadır. Bu nedenle oküler olarak hazırlanan preparatların difüzyon hücre deneylerinin sonuçlarından tek başına bir sonuç çıkarmak çok zordur. %2 oranında pilokarpin hidroklorür içeren mikroemülsiyon formülasyonunun farmakodinamik cevabı %2 oranında pilokarpin hidroklorür içeren kolir ve %4 pilokarpin hidroklorür içeren jele karşı deneysel olarak glokom oluşturulmuş tavşanlar üzerinde araştırıldı. Deneysel glokom oluşturmak için, tavşanların sağ gözlerinin 4 kadranına (0. 15., 30. günlerde) 3 kez 0,2 mi %5 fenol içeren badem yağı enjeksiyonu uygulandı. Uygulama sonrası 59. günde tavşanlarda glokom gelişti. Göziçi basınçları Schiötz tonometre kullanılarak ölçüldü. Glokom gelişen herbir tavşana üç formülasyon uygulandı. Uygulamalar arasında 3'er günlük dinlenme periyotları bırakılarak, bireysel farklılıkların sonucu etkilemesinin önüne geçildi. Mikroemülsiyon dozaj formu, jel ve kolir tipi preparatların farmakolojik etkisi ile karşılaştırıldığında mikroemülsiyonun ve jelin kolire göre gecikmiş bir farmakolojik etki sağladığı ve bu etkinin daha uzun sürdüğü tespit edildi. %2 oranında pilokarpin hidroklorür ile %4 oranında pilokarpin içeren jel'in göziçi basıncı düşürme güçleri arasında ölçümler için varyans analizi sonrasında TUKEY LSD uygulandığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı. Mikroemülsiyonun jele göre düşük doz pilokarpin içermesine rağmen aynı etkiyi göstermesi pilokarpin hidroklorür içeren mikroemülsiyonun olası yan 136etkilerin ortadan kalkabileceği veya minimuma inebileceği sonucu mikroemülsiyonun üstünlüğünü ortaya koymaktadır. Pilokarpin hidroklorür içermeyen mikroemülsiyon formülasyonun tavşan gözü üzerine irritasyon etkisinin değerlendirilmesi amacıyla yapılan iki farklı uygulama her grupta üçer tavşan olacak şekilde yapıldı. Bunlardan birincisinde tavşanların sağ gözlerine 5 gün süreyle günde l'er saat arayla 8 kez l'er damla mikroemülsiyon sol gözlerine ise aynı dozda serum fizyolojik, ikincisinde ise yine sağ gözlerine 5 gün süreyle hergün sabah ve akşam olmak üzre 2 kez l'er damla mikroemülsiyon sol gözlerine ise aynı dozda serum fizyolojik damlatıldı. Her tavşan uygulama öncesi, 3. ve 5. günlerde değerlendirildi. Uygulamalarda ortaya çıkan reaksiyonlar biyomikroskop altında incelenerek değerlendirildi. Pilokarpin hidroklorür içermeyen mikroemülsiyon formülasyonun tavşan gözü üzerine irritasyon etkisinin değerlendirilmesi amacıyla yapılan iki farklı uygulamada 5 gün süreyle hergün sabah ve akşam olmak üzre 2 kez l'er damla mikroemülsiyon damlatılan tavşanlarda ortaya çıkan reaksiyonlar, 5 gün süreyle günde l'er saat arayla 8 kez l'er damla mikroemülsiyon damlatılan tavşanlarda ortaya çıkan reaksiyonlar anlamlı derecede daha az bulundu. Tavşanlar 5. gün sonunda sakrifiye edilerek gözleri çıkarıldı. Çıkarılan gözler histolojik takip şeması uygulanarak preparatları hazırlandı. Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobunda incelenerek fotoğraftandı. Hazırlanan mikroemülsiyon formülasyonun günlük l'er saat arayla 8 saat süreyle 5 gün l'er damla dozda uygulandığında retina'da pigment epitel 137hücrelerinde ödem, kanama ve buna bağlı yassılaşma gözlenmiştir. Bunlara ilave olarak silyar cisim ve korneada lökosit infiltrasyonu ve yangı gözlenmiştir. Aynı dozda serum fizyolojik uygulanan gözlerde herhangibir histolojik patolojiye rastlanmamıştır. Aynı formülasyon 5 gün süreyle günde iki kez (sabah-akşam) l'er damla uygulandığında serum fizyolojik uygulanan kontrol gözlerinde olduğu gibi herhangibir histolojik pataolojiye rastlanmamıştır. Tavşanlar üzerinde yapılan tüm çalışmalardan önce Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Etik Kurulu'ndan onay alındı (2002-28; 2004-45). Yapılan bu çalışmada geliştirilen pilokarpin hidroklorür içeren mikroemülsiyon formülasyonunun tavşanlarda oluşturulan deneysel glokom modelinde göziçi basıncı düşürdüğü, in vitro stabiltesinin iyi olduğu, gerek irritasyon ve gerekse göz dokuları üzerine histolojik açıdan toksik etkisinin olmadığı tespit edildi. Bu sonuçlar değerlendirildiğinde mikroemülsiyon formülasyonun oküler olarak kullanımının uygun olabileceği kanaatine varıldı. Elde olunan bilgiler değerlendirildiğinde in vitro ve in vivo denemelerde uygun sonuçlar veren bu formülasyonun tavşanlarda ve Faz I farmakokinetik çalışmalar şeklinde denenmesi gerektiği kanısındayız. 138

H. SUMMARY To extend the duration in the eye helps to increase the bioavailability. One of the ways used to extend the duration in the eye is the application of the medications in the form of microemulsion. In this study, microemulsion formulation of pilocarpin hydrocloride used in the treatment of glocom is prepared. Microemulsion formulation is prepared by using soya oil as the lipid phase, Span 80, Brij 35 P, 1-Butanol as surfactan and co-surfactan, a- tokoferol as the antioxidizing agent and water as the liquid phase. In order to determine the in vitro stability of the microemulsion formulation, the measurements of parameters such as electrical conductivity, pH, density, refractive index, phase dissociation were taken for 12 months, the measurements of drop size and viscosity were taken for 6 months at three temperatures (4 °C, 25 °C, 40 °C). At the end of these studies, it was determined taht the mentioned parameters did not change and the microemulsion was stable. Malvern Zeta Sizer 3000HSA device was used to determine the drop size of the microemulsion. As the refraction index of the outer phase of the microemulsion formulation (1,446) prepared at the drop size measurement studies were very close the refraction index of the microemulsion formulation (1,443) appropriate results could not be obtained. At the technique used for the drop size measurement, the indices of the external phase of the microemulsion and the refraction index of the microemulsion formulation should be different and the applied light should be refracted. As the 139microemulsion did not apply to this condition, the size of the drops in the microemulsion could not be measured. The viscosity of the microemulsion formulation was examined at 3 different keeping conditions (4°C, 25°C ve 40°C ) for 6 months. There were no significant changes at the viscosity of the microemulsion for 6 months. The results indicated that the microemulsion formulation was stable. The stability studies of the microemulsion containing pilocarpin hydrochloride were held for 4 months at three different temperatures (4°C, 25°C ve 40°C ). The amount of pilocarpin hydrochloride were measured by using HPLC method. At 3 different keeping conditions (4°C, 25°C ve 40°C ) pylocarpin hydrochloride inside the microemulsion was examined to decompose with first degree kinetics. After the calculations by using Arhenius equality the shelf life of the microemulsion ( tgo) were 455, 227, 152 days, respectively. At diffusion cell experiment studies, release rates of the gel containing 4% pylocarpin, microemulsions containing 2% and 4% pilocarpin hydrochloride from an area of 1 cm2 were compared. The experimnts were held at 37± 0,1 °C, using pH 7,4 phosphate buffer solution. At diffusion cell experiment studies, the gel containing 4% pilocarpin was found to release pilocarpin hydrochloride faster and more than microemulsions containing 2% and 4% pilocarpin hydrochloride. When microemulsions containing 2% and 4% pilocarpin hydrochloride were compared between each other, microemulsion containing 4% pilocarpin 140hydrochloride was found to release pylocarpin 1,5 folds faster and more than microemulsion containing 2% pylocarpin hydrochloride. The membranes used at diffusion cell experiment studies are not multi-layered like the eye. The medications applied to the eye are removed with drainag but in diffusion cells the medication is constant at the donor compartment. For this reason, it s hard to get results from diffusion cell experiments alone for occuler preparations. The pharmacodynamical reply of microemulsion containing 2% pylocarpin hydrochloride against solution containing 2% pilocarpin hydrochloride and gel containing 4% pilocarpin hydorchloride was examined at rabbits with experimental glocom. In order to form experimental glocom, almond oil injections containing 0,2 ml %5 phenol were applied to the 4 quadrants of right eyes of the rabbits for 3 times (Days 0, 15 and 30). At the 59 * day after the application, glocom were observed at the rabbits. Intraoccular pressure were measured by using Schiotz tonometer. There formulations were applied to each rabbit with glocom. 3 days of rest periods were given between the applications in order to prevent personal differences to effect the result. When the microemulsion dosage form is compared with preparations of gel and colyr, it was observed that microemulsion and gel had a delayed pharmacologic effect and that this effect was longer. There were no statistically significant differences ( Repeated Measure Anova &TUKEY test) about the strength of decresing intraoccular pressure between microemulsion 141containing 2% pilocarpin hydrochloride and gel containing 4% pilocarpin hydrochloride. Two different applications for determination of the irritational effect of microemulsion not containing pilocarpin hydrochloride on the rabbit eye were held by having three rabbits in each group. At the first one, one drop of emulsion for 8 times with 1-hour intervals were applied to the right eyes of the rabbits for 5 days and serum physiologique were applied at the same way to their left eyes. At the second one, one drop of emulsion is applied to the right eyes 2 times a day, every morning and evening, for 5 days and serum physiologique were applied at the same way to their left eyes. Every rabbit were examined at the third and fifth day before the application. The reactions caused by the applications were examined under biomicroscope. At two different applications for determination of the irritational effect of microemulsion not containing pilocarpin hydrochloride on the rabbit eye, the reactions at the rabbits for which one drop of emulsion is applied 2 times a day, every morning and evening, for 5 days were significantly less than the reactions at the rabbits for which one drop of emulsion for 8 times with 1- hour intervals were applied for 5 days. The rabbits were sacrifed at the end of the fifth day and their eyes were taken. Preparations of the eyes were produced by using histological follow-up scheme. The preparations were examined and photograped under light microscope. When the prepared microemulsion formulation is appiled for 8 times with 1-hour intervals for 5 days edema, bleeding and related flattening were 142observed at the pigment epithel cells at the retina. In addition to these, leukocyte infiltration and inflammation were observed at the ciliary body and cornea. At the eyes which were applied serum physiologique at the same dose, there were no histologic pathology. When the same formulation was applied 2 times a day, every morning and evening, for 5 days, just like in the control eyes which were applied serum physiologique, there were no histologic pathology. The protocol was approved by the Ege University Medical Faculty Animal Ethical Committee (2002-28;2004~45). It was determined that the microemulsion containing pilocarpin hydrochloride developed in this study decreased intraoccular pressure in experimental glocom model formed in the rabbits, it had a fine in vitro stability and it had no toxic effect both on occular tissues histologically and no irritatitonal effect. After the assessment of these results, it was concluded that the microemulsion formulation could be used for occular application. When the data obtained from the study is assessed, we believe that this formulation which had appropriate results at in vitro and in vivo experiments should be tried at studies on rabbits and Phase I pharmacokinetical studies. 143