Doku kültürü metodları ile ecballium elaterum (L.) A. Rich. bitkisinden kallus üretimi

Abstract

98 ÖZET Ecballium elaterium, Akdeniz ülkelerinde çok yaygın olarak yetişen bir bitkidir. Türkiye'de sinüzit tedavisinde kullanıldığı bildirilen bitkinin aktif maddesi kukurbitasin B olarak izole edilmiştir. İlaç geliştirilmesinde klinik testlerde kullanılacak miktarda kukurbitasin B üretimi bu yüzden büyük önem taşır. Bu çalışmanın amacı, bitkinin aktif bileşeni olan kukurbitasin B'nin miktarını çeşitli doku kültürü metodları ile arttırmak olarak tanımlanmıştır. İlk aşama olarak, bitkinin çeşitli organlarından (gövde, kök, yaprak, meyva, tohum gibi) kallus üretmek için uygun besin ortamının belirlenmesine çalışıldı. % 3 sakaroz ve % 0.7 agar içeren MS ortamı temel ortam olarak alındı. BA, NAA, 2,4-D, KIN, IBA ve GA3 gibi çeşitli hormonların farklı konsantrasyonları kültür ortamlarına ilave edilerek kallus oluşturulmaya çalışıldı. Gövde ve yaprak eksplantlarından, 1 mg/L BA ve 0.1 mg/L NAA hormon karışımını içeren ortamda bitkinin diğer kısımlarına göre daha iyi kallus oluşturuldu. Bu hormonların farklı oranları kallus verimini arttırmak için test edildi. En iyi kallus verimi gövde eksplantlarının % 80-1 00'ü ile 0.5 mg/L BA, 5 mg/L NAA içeren ortam ile alındı. Bu aşamayı takiben, bitkinin çeşitli kısımları ve kalluslardaki kukurbitasin B miktarları karşıt faz HPLC tekniği kullanılarak analiz edildi. Licrospher RP 18, 4.6 mm x 250 mm (5um partikül büyüklüğünde) kolonda, hareketli faz olarak asetonitriksu (2:3) karışımı izokratik olarak uygulandı.99 230 nm dalga boyunda UV dedektörün varlığında, akış hızı 1 ml/dk olarak ayarlandı. Liyofilize meyva suyunda % 1.14, gövdede % 0.001, kökte % 0.002 ve yaprak numunelerinde eser miktarda kukurbitasin B tespit edildi. öte yandan, kalluslarda en yüksek kukurbitasin B miktarları, 1 mg/L BA ve 0.1 mg/L NAA hormon karışımı ile 1.25 mg/L BA ve 0.1 mg/L NAA karışımlarını içeren ortamlardan elde edilen kallusların, 1 mg/L BA ve 0.1 mg/L NAA karışımlı ortamdaki 1. alt kültür kalluslarından elde edildi. Bu kültürlerde kukurbitasin B miktarları sırasıyla % 1.126 ve % 0.583 olarak tespit edildi. Sonuç olarak, alt kültürlerin elde edilmesinde hormon oranlarının değiştirilmesinin uyarıcı bir etki oluşturduğu ve kukurbitasin B miktarını arttırdığı gözlendi. Ayrıca kukurbitasin B miktarının 1. alt kültür kalluslarında maksimuma ulaştığı ve sonraki alt kültür kalluslarında zamanla miktarının azaldığı da dikkate değer bir bulgudur.

100 SUMMARY Ecballium elaterium is a widespread plant in Mediterranean countries. In Turkey, the fruit juice is reported to be used for the treatment of sinusitis and cucurbitacin B was isolated as the active anti-inflammatory principle of the drug. Thus, the production of cucurbitacin B is crucial for developing drugs to use in clinical tests. The aim of the present study is defined as to increase the cucurbitacin B yield as the active ingredient of the plant by using various tissue culture techniques. As the first step, we attempted to compose a proper medium to produce callus from the different organs of the plant (i.e. stem, root, leaf, fruit, seed). MS supplemented with 3 % sucrose and 0.7 % agar was used as the base medium. Various hormone combinations of BA, 2,4-D, KIN, IBA and GA3 in different concentrations were added into the culture media to induce the initial callus formation. The stem and leaf explants formed better callus than the other organs, using a medium supplemented with hormone mixtures of 1 mg/L BA and 0.1 mg/L NAA. Different ratios of these hormones were then tested in order to increase the callus yield. Highest yield, 80-100 % of explant, was achieved with the medium containing 0.5 mg/L BA, 5 mg/L NAA. As the following step, the cucurbitacin B contents of the various organs of the plant as well as calli were studied by reversed phase HPLC technique using Licrospher RP 18, 4.6 mm x 250 mm (5u particle size) column, acetonitrile : water (2 : 3) mixture as mobile phase (isocratic), flow101 rate was arranged as 1 ml/min and detector (UV) was set at 230nm wavelength. Cucurbitacin B was detected as 1.14, 0.01, 0.02 % and trace amounts in the lyophilized fruit juice, stem, root and leaf samples, respectively. On the other hand, highest cucurbitacin B yield were detected in the first subculture calli of the stems which were formed in the medium supplemented with 1 mg/L BA and 0.1 mg/L NAA, either prepared from the callus cultures of 1.25 mg/L BA and 0.1 mg/L NAA or 1 mg/L BA and 0.1 mg/L NAA. In these subcultures, cucurbitacin B content were detected as 0.583 and 1.126 %, respectively. It is concluded that variations in hormone ratios in subcultures displayed a stimulating effect and increase cucurbitacin B yield. It is noteworthy that cucurbitacin B quantities reached to a maximum value in the first subculture, but declined in the first subculture calli depending upon time.