Klinik tanıya yönelik DNA hibridizasyonuna dayalı elektrokimyasal genosensör tasarımı

Abstract

Bu çalışmada, indikatörsüz DNA dizi algılama yöntemi dayalı bir elektrokimyasal genosensör tasarımı yapıldı. Yapılan genosensörün klinik olarak uygulanabileceği gerçek hasta örnekleri kullanılarak gösterildi.Çalışmada indikatörsüz DNA dizi algılama yöntemine dayalı Mycobacterium tuberculosis bakterisinin tedavi sırasında rifampin (RIF) antibiyotiğine karşı geliştiridiği direnç mutasyonlarının tayinine yönelik elektrokimyasal bir genosensör tasarımı gerçekleştirildi. Kullanılan prob diziler, bakterinin RIF'e karşı en sık direnç gösterdiği rpoB geninin 507-533. kodonlarını içeren 81 baz uzunluğundaki ?hot-spot? (sıcak bölge)'sine karşılık gelen 5 farklı bölgeden seçildi. Bu prob diziler guanin yerine analoğu olan inozin ile modifiye olarak sentezlendi.Çalışamada tek kullanımlık grafit elektrotlar kullanıldı. 5' ucunda amino-hekzil işaretli prob diziler elektrot yüzeyine kovalent olarak bağlandı. Prob dizi ile kaplı elektrotlar, 81 baz uzunluğundaki sentetik hot ?spot hedef dizi ve tüm bazları hedeften farklı rasgele dizi ile hibridizasyona tabi tutularak alınan guanin yükseltgenme sinyalleri değerlendirildi. Bu iki diziden alınan yanıtlar arasındaki farklılıklar, tasarlanan genosensörün seçimliliğini gösterdi. Genosensörün seçiciliğinin tayinine yönelik olarak, en uygun hibridizasyon koşulları (prob ve hedef derişimi, hibridizasyon, yıkama zamanları, vs..) çalışmaları yapıldı.Genosensör seçimliliğinin saptanmasının ardından, gerçek örnekler ile çalışmalara başlandı. Bunun için ilk etapta mutasyon ayırımının en iyi gözlendiği koşulların tayini yapıldı. Burada tüm probların kaplı olduğu elektrot yüzeylerinde belirli bir prob dizi bölgesinde direnç mutasyonu içen bir PCR ürünü değişen koşullarda hibridizasyona uğratıldı. Alınan yanıtlara göre, mutasyonun bulunduğu prob dizi bölgesinden en düşük diğer bölgelerden en yüksek sinyalin gözlendiği koşullar tayin edildi. Bunların sonucunda tüm PCR ürünü örnekleri kullanılarak mutasyon analizleri gerçekleştirildi.Böylece Mycobacterium tuberculosis'in rifampin antibiyotiğine karşı geliştirdiği direnç mutasyonlarının bir EVET / HAYIR sisemine dayalı tasarlanan elektrokimyasal genosensör ile tayini yapılarak, günümüzde bu amaçla kullanılan rutin yöntemlere alternatif bir yöntem olduğu ve klinik tanıya uygulanabilirliği, ayrıca sahip olduğu tek kullanımlık elektrot sistemi ile bir mikrçip tasarmının temeli olduğu kanıtlandı.

In this study, an electrochemical genosensor based on indicator-free DNA detection method was developed. The applicability of this method on detection of genetic and inherited diseases was showed by using real samples from patients.An electrochemical genosensor was designed based on indicator-fee DNA detection technology for the detection of Mycobacterium tuberculosis resistance mutations to rifampin treatment. Probe sequences represent 5 different parts of the 81 base hot-spot region of the rpoB gene which contains the resistance mutations to rifampin. These probe sequences are inosine modified (guanine ?free).Disposable pencil graphite electrodes (PGE) were used as working electrode. 5? aminohexyl labeled probe sequences were covalently immobilized on to PGE surfaces. Guanine oxidation signals obtained from probe sequences coated PGE surfaces after hybridization with 81 mer synthetic hot-spot and noncomplementary targets. The differences between responses obtained after hybridization with synthetic targets (hot-spot and noncomplementary) proved the selectivity of the genosensor. Optimization ofthe genosensor selectivity was performed by the detection of optimum hybridization conditions (optimum prob and target concentrations, washing buffers, washing and hybridization times).After the optimization of hybridization conditions and genosensor selectivity optimum mutation detection conditions were performed. S probes coated electrode surfaces were hybridized with PCR products which had a resistance mutation at one of the S probe?s region, in different hybridization and washing conditions. Optimum mutation detection conditions were observed, due to the diferences between responses obtained after hybridization with PCR products.Mycobacterium tuberculosis?, rpoB gene mutations to rifampin resistance were detected by using electrochemical genosensor technology. Observed results based on a YES / NO system are showed the applicability of this study on clinical diagnosis, alternative to conventinal methods. Dispoable electrode system technique proved applicability of the system to microchip technology.