HANEIN-1, a novel conserved eukaryotic protein ubiquitously expressed in human tissues

Abstract

HANEIN-1 Na+/I- simporter geninin 3' regulasyon elementleri araştırılırken keşfedilen yeni bir gendir. Bu yeni protein bütün ökaryot canlılarda korunmakla birlikte, bilinen hiçbir proteinle ortak işlevsel bölgelere sahip değildir. Veritabanlarında kıvrım-kıvrım (coiled-coil) bölge içeren-124 hipotetik proteini olarak tanımlanmakta ve 223 amino asit içeren bir protein olduğu tahmin edilmektedir. Bu projededeki amaç HANEIN-1 proteinini çeşitli biyoinformatik ve biyokimyasal analiz yöntemleriyle karakterize etmekti. HANEIN-1 proteinin amino acid dizi benzerliği analizi, bu proteinin memelilerde %75, böcek ve nematodlarda ise % 50 oranında korunduğunu gösterdi. Gen ifade analiz yöntemleri ile HANEIN-1 ifadesinin en fazla iskelet kasında olduğu tespit edildi. Bunun yanı sıra, northern blot analizi ile HANEIN-1 transcript büyüklüğü yaklaşık 1000 bp olarak belirlendi. Western blot tekniği ile protein düzeyinde yapılan çalışmalar, HANEIN-1 geninin 33 kDa büyüklüğünde bir proteini kodladığını ve proteini N-son ucu ve C-son ucu Flag epitopu ile işaretlemenin protein stabilitesini farklı şekilde etkilediğini gösterdi. Laboratuvarımızda yapılan maya ikili-hibrid deneyleriyle, HANEIN-1 proteinin henüz tam olarak karakterize edilmemiş, bir guanin nükleotit değişim faktörü (Guanine Exchange Factor) olan RASGEF1B proteiniyle etkileştiği bulunmuştur. Gen ifade analizleri RASGEF1B ve HANEIN-1 ifade profilleri arasında ters bir bağlantı olduğunu göstermiştir. Son olarak, serin-tarayıcı mutasyon analizleriyle, 194. konumdaki serin mutasyonunun protein stabilitesini önemli ölçüde değiştirdiği saptanmıştır.

HANEIN-1 was first identified in a study investigating 3? transcriptional regulatory elements of the Na+/I- symporter gene. The protein is highly conserved among eukaryotes and bears no domain similarities with any known proteins. In databases, it is described as coiled coil containing-124 hypothetical protein and predicted to encode a 223 amino acid-protein. In this project, our aim was to characterize this highly conserved protein by using several bioinformatics and biochemical methodologies. Sequence similarity search analysis showed that it had around 75% identity in mammals, 50% identity with insects and nematodes. Expressional analysis revealed that HANEIN-1 was expressed in all tissues ubiquitously with a remarkable expression status in skeletal muscle. Beside providing information about expression status of HANEIN-1, northern blotting showed that HANEIN-1 transcript size was approximately 1000 bp. Regarding protein level expression, western blotting revealed that HANEIN-1 encoded a 33 kDa protein and protein stability was affected in a different way upon labeling with Flag epitope at N-ter and C-ter. Yeast double hybrid screening performed in our laboratory showed that HANEIN-1 interacted with RASGEF1B, which was a guanine nucleotide exchange factor not fully characterized. Expressional analysis displayed that RASGEF1B expression profile inversely correlated with HANEIN-1. Finally, serine-scanning mutagenesis analysis showed that site-directed mutagenesis of serine at position 194 significantly affected the stability of the protein.