Serotonin reseptörü ve SERCA genlerinin A7r5 Vasküler Düz Kas Hücre kültürlerindeki ayrımsal ekspresyon kalıplarının işlevsel sonuçları.

Abstract

In vitro farmakolojik ve fizyolojik çalışmalarda vasküler düz kas hücre modeli olarak A7r5 (embriyonik sıçan torasik aort düz kas hücre hattı) 10-25. pasajlar arasında sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak, primer hücre kültürlerinden farklı olarak, ölümsüzleştirilen bu hücrelerde gen ekspresyonunda dramatik nicel ve nitel değişiklikler gözlenmektedir. Bu nedenle çalışmamızda yapısal proteinlere oranla oldukça düşük düzeyde olan 5-HT2A ve SERCA2b gen ekspresyonlarını ve bunlarla ilişkili olası reseptör-aracılı/ reseptörden bağımsız hücre içi Ca+2 dinamiklerindeki değişimler belirlenerek laboratuvarımızda kullanılan bu modelin validasyonu amaçlanmıştır.Hücre kültür ortamında erken (pasaj no: 14-16) ve ileri (pasaj no: 23-24) pasajlara ait hücrelerde ekspresyon analizleri ve hücre içi Ca+2 ölçümleri yapılmıştır. A7r5 (ECACC) hücreleri besi ortamı (DMEM/Ham's F-12) ile kültüre edilmiştir. Her iki gruba ait hücrelerden elde edilen total RNA'lardan ters transkriptaz reaksiyonu ile cDNA oluşturulmuştur. 5-HT ve SERCA2b mRNA düzeyleri kantitatif Real Time PCR ile belirlenmiştir. Serotoninin neden olduğu reseptör aracılı hücre içi Ca+2 konsantrasyonundaki artış ve selektif SERCA inhibitörü siklopiazonik asit (CPA) ile aktive edilen depo-kontrollü Ca+2 girişi (SOCE) Ca+2 belirteci fura-2/AM yüklenmiş hücrelerde yüzeyel spektrofluorometri yöntemi ile gerçek zamanlı olarak belirlenmiştir.Kantitatif Real time PCR sonuçlarına göre 5-HT2A mRNA düzeyinde anlamlı bir değişiklik olmazken, SERCA2b geninin ekspresyonu ileri pasajlarda erken pasajlara göre belirgin olarak artmıştır (P<0.01). İleri pasaj numaralı hücrelerde 5-HT aracılı hücre içi Ca+2 girişi azalırken (P<0.05), CPA'nın neden olduğu depo-kontrollü Ca+2 girişine bağlı hücre içi Ca+2 düzeyi artmıştır (P<0.01).Kültür ortamında hücrelerde eksprese edilen nadir integral membran proteinlerinden biri olan 5-HT2A reseptörlerinin ileri pasajlarda işlevsel değişiklik göstermesi proliferatif sürece katıldığını gösterebilir. SERCA2b geninin ekspresyonunun artması her ne kadar sarkoplazmik retikuluma Ca+2 girişini artıracak gibi gözükse de depo-kontrollü Ca+2 kanalları aracılı yanıtlardaki artış depoların doluluk oranının artan pasajlama sırasında sağlanamadığını ya da başka bir mekanizma ile SOCE'nin uyarıldığını düşündürmektedir. Özetle, ileri pasajlarda dramatikleşen fenotipik farklılaşmaya 5-HT2A ve SERCA genlerindeki ekspresyonel/işlevsel değişiklikler de katkıda bulunabilir. Bu hücre hattı ancak üyeleri eksprese olan sinyal mekanizmalarını çalışmak için uygun gözükmektedir. Ek olarak, in vitro gen ekspresyonunun kontrolü araştırmalarında 24.'den düşük ve yakın numaralı pasajlardaki hücrelerin kullanılması önerilebilir.

Embryonic rat aortic smooth muscle cell line, A7r5, is indiscriminately used between 10th and 25th passages as vascular smooth muscle cell model in pharmacological and physiological studies. Unlike freshly dispersed primary cells, immortalized cells including A7r5s have been reported to have quantitative and qualitative changes after 25th passages. For this reason, we investigated 5-HT2A and SERCA2b gene expressions as well as possible associated changes in receptor-dependent and/or -independent cytoplasmic Ca2+ dynamics in A7r5s in which we routinely used for post-transcriptional gene silencing of candidate genes coding for novel Ca2+ channels.Expressional changes as well as cytoplasmic Ca2+ levels in cells at early (p#14.-16.) and late (p#23.-24.) passages were performed. A7r5 (EACC) cell?s medium was cultured by DMEM/Ham?s F-12. Complementary DNAs were synthesized by reverse transcriptase reaction for total RNAs isolated from both cell groups.and 5-HT2A and SERCA mRNA levels were determined by quantitative Real Time PCR. Serotonin receptor-mediated elevations in cytosolic Ca+2 concentration and the receptor-independent store operated Ca+2 entry activated by the selective SERCA blocker the CPA, were monitored via a front face spectrofluorometric method in Ca+2 ?specific dye fura-2-loaded cells.On the basis of real time PCR results, no significant change was observed in 5-HT2A mRNA levels, however, SERCA2b mRNA expression increased in late passages compared to that of earlier passages (P<0.01). On the other hand, while 5-HTR-mediated Ca+2 entry was decreased in late passages (P<0.01), store operated Ca+2 entry induced by CPA increased significantly (P<0.01).Observation of functional changes of 5-HT receptors, rare integral membrane proteins, in the late passages, suggests us that these receptors may be involved in proliferative processes in immortalized vascular cell lines. Although, increased expression of SERCA2b gene appears to facilitate SR Ca2+ uptake, SR refilling may not be maintained by elevated SOC during subculturing or SOC is activated by another unknown mechanism. In summary, expressional and functional changes in 5-HTR and SERCA genes might contribute to the phenotypical differentiation which becomes more dramatically following 24. passages. Therefore, this cell line may only be appropriate for cellular mechanisms whose signalling members present. It may also be suggested that the close passage numbers earlier than p#24. should also be matched for in vitro gene expression control studies.