Ursodeoksikolik asidin sirolimusa maruz kalmış yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre hattı üzerine etkilerinin incelenmesi

Abstract

Mezenkimal kök hücre (MKH) tedavileri günümüzde tıbbın birçok alanında deneysel ve klinik olarak uygulamaya girmiş önemli tedavi yöntemleridir. Klinik vakalarda organ nakli sonrasında immunsupresif ilaçların yanında destek amaçlı olarak hastalara MKH nakledilmesi gittikçe yaygınlaşmaktadır. Yapılan bu çalışmadaki amaç organ nakillerinde immunsupresif amaçla kullanılan Sirolimus'un, insan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler üzerindeki sitotoksik etkilerinin araştırılması ve antioksidan özelliği bilinen Ursodeoksikolik asitin (UDKA), bu toksisite üzerine etkilerinin araştırılmasıdır.İnsan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre hattı ticari olarak temin edilmiştir. Özel besiyerleri içinde üretilen insan mezenkimal kök hücreleri yeterli sayıya ulaşana kadar 37 ° C'de inkübe edilmiştir. Etken maddelerin sitotoksik etkileri WST-1 testi ile zaman ve doz bağımlı olarak değerlendirilmiştir. Canlılık ve proliferasyon analizleri için ışık mikroskobu ve hücre sayım cihazı, apoptoz ve hücre siklusu değerlendirmeleri için ise Muse® hücre analiz cihazı kullanılmıştır. Biyokimyasal yöntemlerle lipit peroksidasyonu, süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi, katalaz (CAT) aktivitesi, glutatyon peroksidaz (GPX) aktivitesi ölçülmüştür.Gruplara uygulanan ajanların sitotoksik dozları WST-1 testi ile bulunmuştur. Anneksin V ile apoptotik olmayan, erken apoptotik, geç apoptotik, toplam apoptotik ve ölü hücreler hem yüzde olarak hem de hücre/ml olarak hesaplanmıştır. Oksidatif stresle oluşan ve reaktif oksijen metabolitlerinin verdiği zararı belirlemek amacıyla lipit peroksidasyonu, SOD aktivitesi, CAT aktivitesi, GPX aktivitesi ölçülmüştür.İnsan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerde Sirolimus IC50 dozu (48. saat) için 15,85 µM olarak belirlenmiştir. UDKA için ise çalışılan dozlarda sitotoksik etki gözlemlenmemiştir. Bu yüzden en yüksek sabit doz olan 100 µM ile çalışmaya devam edilmiştir. Muse® hücre cihazı ile yapılan ölçümler ve yapılan hesaplamalar doğrultusunda kontrol grubunda ölü hücre %1.03, canlı hücre %98.97 olarak hesaplanmıştır. UDKA grubunda ölü hücreler %2.59, canlı hücreler %97.41 olarak hesaplanmıştır. Sirolimus grubunda erken apoptoz %7.69, geç apoptoz %4.31, ölü hücre %8.10, canlı hücre %79.90 olarak hesaplanmıştır. Sirolimus + UDKA kombine grupta erken apoptoz oranı %3.90, geç apoptoz oranı %1.34, ölü hücre %7.81, canlı hücre %86.95 olarak ölçülmüştür. Hücre siklusu analizinde kontrol ve UDKA grubunda G2/ M fazlarının yüzdeleri sırasıyla % 19.3 ve 18.9' dur. Sirolimus uygulama grubunda G2/ M fazı yüzdesi 15.9 'a düşmüştür. Biyokimyasal bulgular ise MDA düzeylerinde UDKA-kombine grubu; GSH-Px düzeyleri açısından Kontrol- UDKA dışındaki tüm ikili gruplar; CAT düzeyleri açısından kontrol- UDKA; kontrol- kombine; UDKA- Sirolimus ve UDKA- kombine grupları; SOD düzeyleri açısından tüm gruplar arası ikili farkların tümü istatistiksel olarak anlamlı olarak saptanmıştır (p<0.001). Çalışmada, Sirolimusun mezenkimal kök hücrelerdeki apoptozu arttırması literatürle uyumlu bir sonuçtur. UDKA'nın hücre proliferasyonu düzenlediğini gösteren bulguların varlığı ve UDKA'nın antiapoptotik etkileri bu çalışmanın kombine grupta UDKA'nın sirolimus etkisini baskılamasıyla uyumlu olduğu görülmüştür. Organ ve doku nakilleri sonrası immunsupresif tedavi ve yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre uygulamasında, UDKA kullanımı, mezenkimal kök hücrelerin üzerinde pozitif etkiler göstermiştir.

Mesenchymal stem cell therapies are important therapeutic modalities that have been applied experimentally and clinically in many fields of medicine today. Transplantation of mesenchymal stem cells into patients for supportive purposes besides immunosuppressive drugs is becoming common after organ transplantation in clinical cases. The aim of this study is to investigate the cytotoxic effects of Sirolimus, which is used for immunosuppressive purposes in organ transplants, on mesenchymal stem cells derivating from human adipose tissue and to investigate the effects of ursedeoxycholic acid (UDCA), which is known to have antioxidant properties, on this cytotoxicity.The human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell line is commercially available. Human mesenchymal stem cells produced in special media which were incubated at 37 ° C until sufficient numbers were reached. The cytotoxic effects of the active substances were assessed by time and dose-dependent WST-1 test. Light microscopy and cell counting device were used for vitality and proliferation analyzes. Muse was used for evaluation of apoptosis and cell cycle in cell analyzer. Lipid peroxidation, superoxide dismutase (SOD) activity, catalase (CAT) activity, glutathione peroxidase (GPX) activity were measured by biochemical methods.Cytotoxic doses of the agents administered to the groups were found by the WST test. Non-apoptotic, early apoptotic, late apoptotic, total apoptotic and dead cells were calculated as both percent and cell/ml by Annexin V. Lipid peroxidation, SOD activity, CAT activity, GPX activity were measured to determine the damage caused by oxidative stress and reactive oxygen metabolites.In human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, Sirolimus IC50 was determined as 15.85 μM for dozen (48th hour). For UDCA, no cytotoxic effect was observed at the doses studied. Therefore, the study continued with the highest fixed dose of 100 μM. In the control group, according to the measurements made with Muse® cell analyzer the calculations made, the dead cell was calculated as 1.03% and the living cell as 98.97%. In the UDCA group, dead cells were calculated as 2.59% and living cells as 97.41%. In the Sirolimus group, early apoptosis was calculated as 7.69%, late apoptosis as 4.31%, dead cell as 8.10% and live cell as 79.90%. In the combined group of Sirolimus+ UDCA early apoptosis rate was 3.90%, late apoptosis rate was 1.34%, dead cell was 7.81% and viable cell was 86.95%. In the cell cycle analysis, the percentages of the G2/ M phases in the control and UDCA groups were 19.3% and 18.9%, respectively. The percentage of G2/ M phase in the Sirolimus treatment group was reduced to 15.9. Biochemical findings were; MDA- combined group; All binary groups except for Control- UDCA in terms of GSH-Px levels; Control in terms of CAT levels- UDCA; control-combined; UDCA- Sirolimus and UDCA- combined groups; SOD levels were statistically significant (p <0.001).In the study, Sirolimus was found to be compatible with the literature in promoting apoptosis in mesencymal stem cells. The presence of evidence that UDCA regulates cell proliferation and the antiapoptotic effects of UDCA have been shown to be consistent with suppressing the Sirolimus effect in the combined group. In immunosuppressive treatment after organ and tissue transplantation and in adipose tissue-derived mesenchymal stem cell application, the use of UDCA showed positive effects on mesenchymal stem cells.