Periodontal doku mühendisliği uygulamaları için geliştirilen üç fazlı prototip membranların rejeneratif kapasitelerinin in vitro olarak incelenmesi

Abstract

Son yıllarda gelişen periodontal doku mühendisliği yaklaşımı ile yönlendirilmiş doku rejenerasyonu prensipleri birleştirilerek yeni bir prototip membran tasarlandı ve üretildi. Bu çalışmanın hedefi polikaprolakton (PCL), nano hidroksiapatit (nHA), kollajen (COL) ve rhBMP-7 içeren ve hiyerarşik olarak görev görmesi planlanan çok katlı membranın MC3T3-E1 (fare osteojenik) hücrelerinde etkisini araştırmak, nHA'nın kemik rejenerasyonuna katkısını ve rhBMP-7 yüklü membranın salım kinetiklerini ve hücre fonksiyonlarını değerlendirmektir. Membranların fiziksel özelliklerini incelemek amacıyla SEM, EDX, FTIR-ATR ve salım çalışmaları gerçekleştirildi. Çalışmalar sonucunda nHA ve kollajenin yapıya katıldığı ve çok katlı membranın SEM görüntülerinde çekirdek tabakasının por genişliğinin osteoblastlar için uygun büyüklükte olduğu (337 nm) bulundu. rhBMP-7 içeren membrandaki rhBMP-7'nin %42'sini ilk 4 saat içinde, kalanının ise 3 gün boyunca salım gösterdiği bulgulandı. Yapılan in vitro çalışmadan elde edilen SEM görüntülerinde ise, membranın dış tabakasına hücrelerin tutunduğu, yer yer içerisine girdiği ve ekstrasellüler matriksi oluşturduğu bulgulandı. Tüm membranlarda hücrelerin canlı olduğu ve en çok rhBMP-7 varlığında çoğalma olduğu MTT analizi ile gözlendi. Hücrelerin osteoblastik farklılaşmasını gösteren belirteçler ALP analizi ile, osteojenik gen sonuçları gerçek zamanlı RT-qPCR ile belirlendi. rhBMP-7'li grupta ALP aktivitesi ve COL-1, Runx2, OCN, OPN gen düzeyleri anlamlı olarak yüksek bulundu. Bu çalışma üç farklı içerikte hazırlanmış membranlardan rhBMP-7 ile yüklenmiş PCL, nHA, COL içeren üç fazlı prototip membranın periodontal doku rejenerasyonda etkin bir membran olabileceğini göstermiştir.

A novel prototype membrane has been designed and fabricated with a graded structure (polycaprolactone- PCL, collagen- COL, nanohydroxyapatite- nHA) by combining recently emerging periodontal tissue engineering field with guided tissue regeneration principles. The purpose of thesis study is to research effect of the triphasic membranes, which are planned to serve hierarchically on MC3T3-E1 cells, to evaluate nHA for bone regeneration and to release kinetics of the membrane loaded with rhBMP-7. SEM, EDX, FTIR-ATR and release studies of the membranes which defines membranes' physical properties have been performed. As a result of these studies, it has been determined nHA and collagen joined the membrane successfully, the core layer had a suitable size for osteoblasts (337 nm). It was also discovered that 42% of rhBMP-7 was released during the first 4 hours and the remainder was released during the next three days. In SEM images, cells adhere to even at same places penetrate into the inner layer of the membrane and ECM formed. It was observed through MTT analysis that vitality of the cells within the membranes as well as greatest rate of proliferation occured in presence of rhBMP-7. Osteoblastic differentiation markers have been determined through ALP analysis and osteogenic gene results through real time RT-qPCR. ALP activity COL-I, Runx2, OCN, OPN gene levels have been found significantly higher in BMP-7 group. In conclusion, the data we obtained in three different prototype membranes, the membrane laden with rhBMP-7 and containing PCL, nHA, COL can be an effective membrane in periodontal tissue regeneration.