Development and scale-down of enzyme analysis methods for high throughput screening of important soil enzymes

Abstract

Enzimler genelde sürdürülebilir biyoekonominin `İsviçre çakısı` olarak kabul edilir ve bu nedenle ekonomik önem arz ederler. Bunların arasında amilaz,proteaz, fosfataz ve üreaz özellikle önem taşir ve biyoteknoloji araştırmalarında üretim yöntemleri yer tutar.Endüstriyel bioteknolojinin kalbi üretici (mikro) organizmanın varlığıdır. Rekombinant DNA teknolojilerin ve sentetik biyoloji gereçlerinin kullanılması büyük ilgi görüyorsa da, doğanın ve doğal üreticilerin henüz keşfedilmemiş potansiyeli, yalnızca ekonomik amaçla değil, aynı zamanda zaten bilinen süreçler için bile yeni mekanizmaları keşfetmeye uygun olması sebebi ile ilgi çekicidir. Bupotansiyelin hayata geçirilmesi için çok sayıda çevresel numune arasında arzu edilen enzim üreticilerinin tanımlanmasına imkân verecek hızlı ve ucuz yüksek verimli tarama yöntemleri geliştirilmelidir. Bu da enzim özelliklerinin ayrıntılı olarak incelenmesi, mevcut yöntemlerin değiştirilmesini veya gerektiğinde yeni yöntemlerin geliştirilmesini gerektirir.Bu tez, adı geçen dört enzimlerin ölçülmesi veya üreticilerinin taranması için yöntemler geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu yöntemler ölçek küçültme çerçevesinde, 96-kuyulu plakalarda otomasyona müsait, spektroskopik ve kolorimetrik yaklaşımların birleşimine dayanmaktadır. Metotlar önce aktivitesi bilinen tip suşları kullanılarak test edilmiş, daha sonra 537 bilinmeyen mikroorganizmadan oluşan bölümümüzde mevcut kültür koleksiyonunu taramak için kullanılmıştır. Bu yöntemi kullanarak yeni güçlü üreticiler keşfedilmiş ve özellikleri raporlanmıştır.87 izolat üreaz pozitif olarak ve 76 izolat amilaz pozitif olarak gözlendi.Bu organizmalar arasinda 6ys29 hem üreaz hem de amilaz pozitiftir. Proteaz üreticileri olarak, 15 izolat tespit edild. 5ys19, 7ys60, 7ys66 proteaz ve amilaz pozitifken, 6ys59, 6ys33, 5ys5 fosfataz ve amilaz,7ys39, 5ys23, 7ys76, 5ys42 üreaz ve fosfataz pozitif izolatları olalarak keşfedilmiştir.

Enzymes are generally accepted as the `Swiss-army knife` of sustainable bio-economy and as such, they represent an economical significance. Chief among those amylase, protease, phosphatase and urease for which various studies about their production methods is an attractive topic in biotechnology research.The heart of industrial biotechnology is the availability of the producer (micro)organism. While the recombinant-route involving the use of advanced molecular techniques e.g. synthetic biology toolbox are of great interest, the immense undiscovered potential of nature and natural producers is very appealing, not only for economical purpose, but also from scientific point of view, allowing to discover possibly new mechanism even for already known processes. To materialize this potential, fast and affordable, high throughput screening methods that will allow identification of producers of desired enzymes among large number of environmental samples, need to be developed. This requires in turn, detailed study of enzyme properties, modification of available methods or development of novel methods if necessary.This thesis aims to set up such high throughput methods for four aforementioned enzymes. The developed, scaled-down methods are based on a combination of spectroscopic and colorimetric approaches, with automatization and miniaturization, on 96-micro titer well plates (MTP). The methods are first tested using type strains for which the activity are known. Later, the developed methods are used to screen the in house available collection, consisting of 537 unknown microorganisms. Using this method new strong enzyme producers were discovered and reported.87 isolates was observed as urease positive and 76 isolates was observed as amylase positive. Among those organisms 6ys29 is both urease and amylase positive. 15 isolates was detected as protease producers. 5ys19, 7ys60, 7ys66 are both protease and urease, 6ys29 is amylase and urease positive microorganism. 7ys48 is protease and amylase positive. 6ys59, 6ys33, 5ys5 are phosphatase and amylase, 7ys39, 5ys23, 7ys76, 5ys42 are urease and phosphatase positive isolates.