Capsidiol production from Nicotiana tabacum cv. Xanthi liquid cell suspension cultures

Abstract

Bitkiler çok fazla sayıda sekonder metabolit üretme kapasitesine sahiptirler ve bu metabolitler kozmetik, ilaç, gıda ve kimya endüstrilerinde kullanılmaktadırlar. Bitkiler tarafından üretilen bu sekonder metabolitler, genellikle bitki savunma ve iletişimi için kullanılır. Antimikrobiyal özelliğe sahip fitoaleksinler, bitkilerin birincil metabolizmasında yer almazlar, ancak bitki strese girdiği zaman ya da herhangi bir saldırıya maruz kaldığında üretilirler. Bisiklik sekuterpen olan kapsidiol, Capsicum annuum (biber) ve Nicotiana tabacum (tütün) bitkilerinde biyotik stres yaratan Phytopthora infestans gibi fungal patojenlere karşı üretilen ana sekonder metabolittir. Genellikle bu sekonder metabolitler gelişmiş tüm bitkiden elde edilirler. Ancak bütün bir bitkinin kullanımı çeşitli kaynaklardan (gübreler, tarım ilaçları, böcekler, hastalıklar vb.) gelen kontaminasyon riski taşır. Sekonder metabolitleri üretmenin daha uygun bir yolu da bitki hücre süspansiyon kültürleridir. Bu çalışmada, farklı eksplant kaynağı kullanılarak Nicotiana tabacum cv. Xanthi kallus kültürü oluşturulmuştur. Kallus oluşumu en fazla yaprak eksplantından yüzde 95 oranında 21 günde elde edilmiştir. Büyüme parametreleri artan ağırlığın zamanla ölçülmesiyle optimize edilmiştir. Karakterize edilen kallus daha sonra organogenez ile bütün bir bitki haline getirilip, sera koşullarında adaptasyonu sağlanmıştır. Çiçeklenme sürecine kadar geçen süre, yaklaşık dört ay, önceki çalışmalarla benzerlik göstermektedir. Kallus kültüründen hücre süspansiyon kültürü elde edilmiştir ve hücrelerin mikroskobik analizi ve yaş ağırlık ölçümüne dayalı büyüme parametreleri ile karakterize edilmiştir. Kapsidiol üretimini indüklemek için beş farklı elisitör kullanılmıştır. Örneklerin organik çözücü ile ekstraksiyonundan sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve kütle spektrometresi (MaS) ile analiz yapılmıştır. Tütün hücre süspansiyonunda kapsidiol üretimi için maya ekstraktı (1 g/L) ve salisilik asit (0,5 mM) en iyi elisitör adayları olarak bulunmuştur. Bu çalışma, tütün hücre süspansiyon kültüründen büyük ölçekli kapsidiol üretimi için bir temel oluşturacaktır.

Plants are capable of producing a tremendous amount of secondary metabolites that can be used in chemical, food, pharmaceutical, and cosmetic industries. The purpose of these secondary metabolites which accumulate in plants is generally for defense and communication. Phytoalexins are antimicrobial compounds which are not produced in primary metabolism of a plant; however, as a result of stress or infection, phytoalexins accumulate. Capsidiol, a bicyclic sesquiterpene, is the main phytoalexin known to be accumulated in Capsicum annuum (pepper) and Nicotiana tabacum (tobacco) as a response to biotic fungal stress such as Phytophthora infestans. In general, these secondary metabolites are harvested from whole plants, yet the whole plant has a risk of contamination from various sources such as fertilizers, agrochemicals, pests, and diseases. The more relevant way to produce secondary metabolites is using plant cell suspension cultures. In this study, callus formation was achieved from different explant sources of the tobacco plant. Leaf explants demonstrated the highest callus generation rate with 95 per cent in 21 days. Growth parameters were optimized by measuring increasing fresh weight over time. Characterized calli were later regenerated into the whole plant via organogenesis and ad acclimatized in greenhouse conditions; The period of time needed to reach the flowering stage from callus culture was approximately four months, consistent with the previous studies. Callus-derived cell suspension culture was established and characterized by microscopic analysis of the cells and growth parameters via fresh weight measurements. In order to induce capsidiol production, five different elicitors were utilized. After organic solvent extraction, samples were analyzed for the availability of capsidiol with high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MaS). Yeast extract (1 g/L) and salicylic acid (0.5 mM) are found to be the best elicitor candidates for capsidiol accumulation in tobacco cell suspension culture. This study will be a base for large scale production of capsidiol from tobacco cell suspension cultures.