Design of fluorescent probes for bioorthogonal labeling of carbonylation in live cancer cells

Abstract

Oksidatif stres, reaktif oksijen türlerinin canlı hücreler, dokular ve organlarda oluşturduğu hasar olarak bilinir. Nörodejeneratif hastalıklar ve diyabetle birlikte, tümör gelişim ve ilerlemesine neden olan serbest radikaller hemen hemen tüm kanser türlerinde yüksek düzeyde bulunmaktadır. Reaktif oksijen türleri kanser hücrelerinde çoğalma, gelişim ve ölüm gibi durumları kontrol eder, bu nedenle serbest radikallerin özgün hedef olarak kullanılması kanser hücrelerinin ölümünü tetikleyebilir. Bu tezde, oksidatif stresse bağlı gelişen protein karbonilasyonunun, hücre içerisine verilen özgün biyoortogonal floresan moleküller ile görüntülenmesi amaçlanmıştır.Oksidatif stres sonucu biyomoleküllerde oluşan karbonilasyonun, biyoortogonal işaretlenmesi, kanserin agresifliğinin belirlenmesinde önemli bir yere sahiptir. Bu bağlamda sentezlenen hidrazin ve amin bazlı moleküllülerin spektroskopik özellikleri karakterize edilmiştir. Nükleofilik yapıları nedeniyle hidrazin veya amin bazlı floroforlar, canlı hücrelerde bulunan karbonil gruplar ile hızlı hydrazone veya imin reaksiyonu gerçekleştirirler ve bu reaksiyon hızı, kanser hücre hatlarına göre farklılık göstermektedir. Buna bağlı olarak hidrazin bazlı 2-Hidrazin 5-Nitrofenol molekülünün karbonil gruplar ile reaksiyona girmesiyle spektroskopik değişime uğrayarak hidrazon oluşturur. Bu çalışmada, oksidatif stres düzeyine bağlı olarak hücre içerisinde değişiklik gösteren floresan yoğunluk miktarları, ACHN ve A498 kanser hücre hatlarının metastatik özelliklerinin ayırt edilmesinde kullanılmıştır. Hücrelerde oksidatif stres H2O2 ile indüklendiğinde, A498 hücresinde ACHN hücresine kıyasla daha fazla protein karbonilasyonu gerçekleştiği tespit edilmiştir. Diğer yandan, hücreler serum açlığına sokularak oksidatif stres uyarıldığında protein karbonilasyonu seviyesinin metastatik ACHN hücrelerinde daha yüksek olduğu bulunmuştur. Tez kapsamına geliştirilen 2-Hidrazin 5-Nitrofenol molekülü kanserin tespitinde ve kanserin moleküler evrelerinin belirlenmesinde kullanılabilecek belirteç boya niteliği taşımaktadır.

Oxidative stress is known as the steady state level of oxidative damage in live cell, tissue, or organ, caused by the reactive oxygen species (ROS) such as free radicals. Along with neurodegenerative diseases and diabetes, high levels of reactive oxygen species have been noticed in almost all cancers, where they promote many aspects of tumor development and progression. Bioorthogonal labeling of oxidative stress-induced carbonylation of biomolecules have a critical role in the identification of cancer aggressiveness. Hydrazine or amine-based fluorophores act as strong nucleophiles that react rapidly with carbonyl sections in live cells. In this study, hydrazine and amine derivatives were synthesized in order to detect ROS induced protein carbonylation in various cancer cell lines. 2-Hydrazine-5-nitrophenol was utilized as a novel bioorthogonal fluorescent probes to demonstrate labeling of carbonylated biomolecules. Reaction between carbonyl group and hydrazine containing fluorophore yielded in hydrazone which maintained a spectroscopic alteration. Microscopic and fluorometric analyses were used to distinguish the exogenous and endogenous ROS induced carbonylation profile in A498 primary site and ACHN metastatic site renal cell carcinoma (RRC) cell lines. When cells were treated with H2O2 as an exogenous ROS inducer, A498 cell line demonstrated higher carbonylation level. On the other hand, serum starvation as an endogenous ROS inducer resulted in higher carbonylation level in ACHN metastatic site RCC cell line. The probe developed here may be used as a small molecule in the development of new diagnostics approach in the molecular staging of cancer.