Identification of small molecules that enhance murine bone marrow derived mesenchymal stem cell expansion

Abstract

Mezenkimal kök hücreler (MKH), immüno modülatör özellikleri (immün sistemi kontrolü), homing yetenekleri (hasarlı bölgelere göç edebilme) ve farklılaşma kapasiteleri ile transplantasyon-terapileri için çok önemli bir aday haline geldiler. MKH'ler yetişkinlerde bulunan, multipotensi özelliği gösteren ve kendini yenileme kabiliyetine sahip hücrelerdir. Kemik iliği, adipoz dokusu, kordon, dental doku dahil olmak üzere bir çok dokudan izole edilebilirler. Ancak, mobilizasyon, ekpansiyon ve farklılaşma kapasitelerinin anlaşılması konularında bir çok soruna rastlanmaktadır. Eğer bu sorunların üstesinden gelinebilirse, deneysel ve klinik çalışmalar için çok önemli bir aday haline gelebilirler. Çalışmamızda, fare kemik iliğinden izole edilen MKH'leri küçük moleküller ile çoğaltmaya odaklandık. Ayrıca küçük molekül muamelesi sonrası mobilizasyonda da artış görmeyi umduk. Öncelikli olarak, WST-1 denemeleri ve Hoechst boyamaları sonucunda dört etkin molekül seçildi; SKF96265, SB203580 (p38-MAPK İnhibitörü), GSK-3 İnhibitörü ve StemReginin I (AhR Antagonist). Hücre mekanizmalarında etkilerini görmek için, hücre döngüsü (DAPI ve Hoechst boyamaları) ve apoptoz analizleri (Annexin V-FITC ve PI boyamaları) yapıldı. Kontrolle (DMSO) karşılaştırıldığında, SKF96265 ile muamele edilmiş MKH populasyonu haricinde sonuçlarda herhangibir olumsuz etki görülmedi. SKF96265 (CCE İnhibitörü) hücrelerin G1 fazında duraklamaya neden oldu ve yüksek ölüm oranları gözlendi. Sonrasında, HDR, CDKI ve S-Fazı genlerindeki değişimleri görmek için RT-PZR yapıldı. SKF96265'in RAD51 ve PCNA HDR gen ekspresyonlarını anlamlı bir şekilde arttırdığı görüldü. İlk seçilen molekül olan GSK-3 inhibitörü serbest sitozolik β-katenini stabilize ederek farklılaşmayı engellemektedir. SB203580 ise p38-MAPK yolağına özgü bir inhibitördür ve seçilenler arasından en etkili molekül olduğu gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışma ile murin kemik iliği kökenli MKH'lerin in vitro'da çoğaltılması için sağlam ve güvenilir bir yöntemin temelleri atılmıştır. İleride, etkili küçük moleküllerden yapılan kokteyllerin denenmesi, immüno modülasyon ve GvHD için küçük moleküllerle muamele edilmiş MKH'ler ile in vivo çalışmalar yapılabilir. Temel amaç, bu bilgileri klinik alanda kullanabilir hale getirmektir.

Mesenchymal stem cells became a great candidate for transplantation-based therapies with their immunomodulatory traits (ability to regulate immune response), homing capability (migration to injured sites), differentiation ability to all three embryonic lineages; only after perfecting isolation protocols and expension tecniques. They are present in the adult body, they can self-renew themselves and exhibit multipotency. They can be obtained from a variety of tissue types including; bone marrow, adipose tissue, umbilical cord, dental tissue. On the other hand, there are major challenges on mobilization, expansion and understanding the differentiation mechanism. If these challenges can be overcome, MSCs show great potential for experimental and clinical applications. In our study we focused on expansion of mBM-MSCs with small molecule treatment. With that, we hope to achive increased mobilization results as well. We selected four effective molecules primarily by WST-1 cell viability assay, the assay was supported by hoechst staining for cell counting; SKF96265, SB203580 (P38-MAPK Inhibitor), GSK-3 Inhibitor and StemReginin 1 (AhR Antagonist). To see the effects on cell mechanism; cell cycle analysis with DAPI and Hoechst staining, apoptosis analysis with Annexin V-FITC and PI staining were conducted. The results did not suggest any misconduct on our MSC culture by the expanding effects of selected small molecules except SFK96265, a CCE inhibitor, which caused G1-phase arrest and the cell population treated by had increased cell death rates. Next, we performed RT-PCR to check if there were any negative changes on HDR, CDKI, S-Phase-related gene expressions. SFK96265 also showed highly significant upregulation of RAD51 and PCNA HDR-related genes expressions. Our first molecule is a GSK-3 inhibitor that stabilizes free cytosolic β- catenin and inhibits differentiation. Next candidate is a p38-MAPK inhibitor, which is the most effective small molecule. In conclusion, we layed a foundation for a safe and reliable way of in vitro expansion of murine BM-MSCs. Our next step is treatment of the mixture of compatible small molecules, in vivo trials by small molecule treated stem cell transplanation for GvHD and immunomodulation therapy. With all this, our goal is to carry this knowledge to therapeutic field.