Lignin degradasyonunu gerçekleştiren actinomycetes enzimleri hakkında bir araştırma

Abstract

ÖZET Bu çalışmada, lignoselülolitik aktivitelerinin araştırılması amacı ile Türkiye'nin farklı bölgelerinden izole edilmiş ve tanımlanmış olan üç termofilik Streptomyces susu seçilmiştir. Karbon ve enerji kaynağı olarak % 0,2'lik ksilan içeren sıvı kültür ortamlarında büyütülmüş olan tüm suşlar, en yüksek lignoselülolitik aktivitelerini inkübasyon periyodunun 1-2. gününde göstermişlerdir. Lignoselülolitik enzimlerin üretimi üzerine karbon kaynaklarının ve pH'm etkileri belirlenmiştir. En iyi lignoselülolitik aktivitenin ksilan içeren kültür ortamlarında, pH 7-9 aralığında gösterildiği belirlenmiştir. Çalışılan suşlar arasında en yüksek peroksidaz aktivitesi Streptomyces sp. NT508 (1,825 U/mg, 0,723 U/mL) tarafından, en yüksek endoksilanaz aktivitesi Streptomyces sp. TA212 (68,566 U/mg, 30,325 U/mL) tarafından ve en yüksek endoglukanaz aktivitesi Streptomyces sp. TA208 (8,295 U/mg, 3,65 U/mL) tarafından sırasıyla [% 1,0 (w/v), 0,6 (w/v) ve 1,2 (w/v)]'lik yulaf ksilanı içeren kültür ortamlarında üretilmiştir. Çalışılan suşlar tarafından üretilen ekstrasellüler peroksidazlar, substrat olarak kullanılan ve fenolik bileşiklerden oluşan L-DOPA, 2,4-DCP, veratril alkol. Dye azure-B ve guaiakol'e karşı pozitif aktivite göstermişlerdir. Ekstrasellüler peroksidaz aktiviteleri için optimum sıcaklık ve pH ise, sırasıyla 50-65 °C ve 8,0 olarak belirlenmiştir. Streptomyces sp. suşlan tarafından üretilen ekstrasellüler peroksidazların termostabilitelerinin belirlendiği çalışmada ise enzimlerin, substratsız ortamda yarı ömürlerinin 60 °C'de 3-5 saat, 70 °C'de ise 1-2 saat olduğu saptanmıştır. Streptomyces sp. suşlan tarafından üretilen peroksidaz enzimlerinin, zymogram olarak geliştirilen PAGE analizi sonucunda her bir susun 3 farklı peroksidaz izoformuna sahip olduğu belirlenmiştir. Streptomyces sp. NT508 tarafından üretilen ve SDS-PAGE analizleri ile de doğrulanan peroksidaz izomerlerinin rölatif moleküler kütleleri ise jel fıltrasyon kromatografisi ile 75 kDa (P-l), 48 kDa (P-2) ve 21 kDa (P-3) olarak belirlenmiştir. Streptomyces sp. NT508 tarafından üretilen ekstrasellüler peroksidaz izomerlerinden birisi (P-3) ise jel filtrasyon anyon değiş-tokuş kromatografıleri ile konsantre ham kültür sıvısından kısmi olarak saflaştırılmıştır. Bu enzimin (P-3) son saflaştırma spesifik aktivitesi ve saflaştırma kat-sayısı ise 34,36 U/mg protein ve 1 8,73-kat olmuştur. Ekstrasellüler peroksidaz enzimlerinin substrat yokluğunda gösterdiği sıcaklık stabiliteleri ve geniş bir pH aralığında optimum aktivite göstermeleri, bu enzimlerin ve suşlann kağıt ve kağıt hamuru ya da miyokardiyal enfarktüsün belirlenmesinde yardımcı olan serum kolesterolünün tayini gibi potansiyel endüstriyel ve diyagnostik uygulamalar için olan uygunluğuna işaret etmektedir. Anahtar kelimeler: Degradasyon, endoksilanaz, lignoselüloz, peroksidaz, lignin, Streptomyces.

ABSTRACT In this study, ligninolytic activities of three thermophilic Streptomyces strains, which were isolated from different regions in Turkey and identified, were investigated. All of these strains which were grown in the presence of 0.2% (w/v) xylan as sole carbon and energy source exhibited the greatest lignocellulo lytic enzyme activities at the lst_2nd day of the incubation period. Effects of the carbon sources and pH on the production of lignocellulolytic enzyme activities were investigated. The highest lignocellulolytic enzyme activities were observed on the xylan containing culture medium at the pH range of 7-9. Among the strains used, the highest peroxidase activity was produced by Streptomyces sp. NT508 (1.825 U/mg, 0.723 U/mL), the highest endoxylanase activity was produced by Streptomyces sp. TA212 (68.566 U/mg, 30.325 U/mL) and the highest endoglucanase activity was produced by Streptomyces sp. TA208 when all strains growing on oat spelt xylan [1.0% (w/v); 0.6% (w/v) and 1.2% (w/v) respectively]. Extracellular peroxidases which were produced by the strains used, were demonstrated positive activities against phenolic compounds, such as L-DOPA, 2,4-DCP, veratryl alcohol, Dye azure-B and guaiacol. Optimum temperature for extracellular peroxidase activities were ranged from 50 °C to 65 °C and pH was 8.0. The extracellular peroxidases showed a half-life of 3-5 h at 60 °C and 1-2 h at 70 °C in the absence of substrate. PAGE analysis which was developed as zymogram showed that all Streptomyces strains used were produced 3 peroxidase isoforms. Three peroxidase isoforms produced by Streptomyces sp. NT508 were identified by gel filtration chromatography with apparent molecular masses were 75 kDa (P-l), 48 kDa (P-2) and 21 kDa (P-3) confirmed by SDS- PAGE. One of the isomers of peroxidase (P-3) produced by Streptomyces sp. NT508 was partially separated from crude concentrated culture supernatant using gel filtration and anion-exchange chromatography. This enzyme (P-3) was purified with the final specific activities and purification factors of 34.36 U/mg of protein and 18.73-fold. The temperature-stability of the extracellular peroxidases in the absence of substrate and the activity over a broad pH range signify the suitability of these enzymes and strains for potential industrial and diagnostic applications, such as pulp and paper production or serum cholesterol determination as a means of assessing myocardial infarction. Key words: Degradation, endoxylanase, lignocellulose, peroxidase, lignin, Streptomyces. II