Balık patojeni bazı vıbrıo bakteriyofajların izolasyonu ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, ülkemizde deniz balıkları yetiştiriciliğinde ekonomik değere sahip Dicentrarchus labrax (deniz levreği)'ta yüksek ölüm oranlarına sebebiyet veren Vibriosis etkeni Vibrio bakterilerinin izolasyonu, karakterizasyonu; patojen Vibrio bakterilerinin doğal düşmanları olan bakteriyofajlarının izolasyonu ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. Bu tez kapsamında deniz levreğinin; karaciğer, mide-barsak, ve böbrekleri homojenize edilmiştir. Homojenize edilen organlar, %1,5 NaCl içeren Triptik Soy Broth (TSB) besiyerine ekilmiştir ve 25 °C' de 24 saat inkübe edilmiştir. İzole edilen bakteriler, Vibrio bakterileri için seçici besiyeri olan Tiyosülfat Sitrat Safra Tuzları Sukroz Agar (TCBS)'ye ekilmiştir ve oluşan sarı koloniler izole edilmiştir. Bakteriyofaj izolasyonu; deniz suyundan, 0.22 μm por çaplı filtreler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çift tabaka agar yöntemi ile bakteriyofaj varlığı tespit edilmiştir. Faj plakları gözlemlenen 5 bakterinin karakterizasyonu, API 20E hızlı tanı kiti ve 16S rRNA dizi analizi yapılarak belirlenmiştir. API 20E test kiti ile Aeromonas hydrophila olarak belirlenen bakteri izolatları 16S rRNA dizi analizleri sonucunda Vibrio anguillarum olarak tanımlanmıştır. Konak bakteri suşlarına ait faj izolatları, tek plak yöntemi saflaştırılmıştır. Fajların genomik DNA'ları Hind III restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilerek genom büyüklükleri analiz edilmiştir. Saf faj izolatları, uranil asetat ile negatif boyanarak Transmisyon Elektron Mikroskop (TEM) ile görüntülenmiştir. Fajların morfolojik özellikleri belirlenmiştir.

Aquaculture in marine environments is one of the fastest growing food production sectors worldwide. But there is a lot of bacterial pathogen that can threaten the marine animals in marine ecosystem. Antibiotics are used to prevent bacterial infections but using of antibiotics brings along some problem with it. However antibiotics resistance can be rapidly developed. Due to disadvantages comes from consumption of antibiotics in aquatic environment, there is need for alternative methods control bacterial infections. Phage therapy can be successfully applied in aquaculture. Over the last decade, the use of bacteriophages (phages) increased, because of viruses that specifically infect bacteria and act as their natural predators. Sea bass (Dicentrarchus labrax L., 1758) is the most favourable cultured fish species in Turkish coastal water. It is very important to solve problems about sea bass diseases due to its high economic value and increasing the cultivation of this species. So the characterization of Vibrio bacteriophages is an important issue to control bacterial infections.In this study, tissue samples were taken from kidney, stomach, intestine and liver of the sea bass and inoculated Tryptic Soy Broth with 1.5% sodium chloride. Colonies were purified by three times streaking on Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose Agar (TCBS). Bacteria were than analysed by API 20E identification kit and 16S rRNA analyse performed as well. Based on 16S rRNA gene similarity, bacterial isolates were presumptively identified as Vibrio anguillarum according to NCBI BLAST analysis. Bacteriophages were isolated from sea water samples. Presence of bacteriophages were determined by the double layer agar method. Phages purified by using enrichment techniches and plaque assay. Phage DNAs were extracted from high titer phage isolates. DNAs was electrophoresed to determine size of phage DNA. Phage containing filtrates were stained with uranyl acetate and then inspected with a Transmission Electron Microscopy (TEM).