Glioblastome multiforme hücre kültürlerinde (U-87 MG ve T98G) VEGF sentezinin (-/-) gossipol (AT-101) ile inhibisyonu

Abstract

Giriş: Glioblastoma multiforme (GBM), beyin tümörleri arasında en yaygın görülen ve en ölümcül olan tiptir .Çoğalan hücrelere besin ve oksijen desteğinin sağlandığı fizyolojik bir süreç olan anjiyogenez, GBM tümörlerinin gelişiminde, büyümesinde ve metastazında kritik bir rol oynar. Normal dokularda ve tümör dokularında pro-anjiyojenik faktörler aracılığıyla yeni kan damarı oluşumu, birçok sinyal yolağının aktivasyonunu gerektirir.Pro-anjiyogenik faktörlerin en önemlilerinden biri Vasküler endoteliyal çoğalma faktörüdür (VEGF). Bu yüzden kanser hücrelerinde VEGF sentezinin baskılanabilmesi, malignitesi düşük gliomaların yüksek malignite özelliği kazanmasının engellenmesinde ve GBM metastazının yavaşlatılmasında önemli rol oynar. Tümör canlılığının korunması kan damarlarına bağlı olduğundan anti-anjiyojenik ajanların araştırılması tedavi geliştirilmesinde önemli bir konudur.Gossipol, pamuk bitkisinden (Gossypium species) elde edilen sarı renkli, hücreye nüfuz edebilen ve birçok dehidrogenaz enziminin inhibitörü gibi davranan, polifenolik bir aldehiddir AT-101, Gossypol ajanının -(-) enantiomeridir ve (+)- izomerinden daha sitotoksik etkili olduğu belirlenmiştir. AT-101'in çeşitli kanser hücre hatlarında antiproliferatif etkiye sahip olduğunu gösteren pek çok çalışma mevcuttur .Bu çalışmada, AT-101'in, GBM hücre kültürlerindeki (U-87MG ve T98G) sitotoksik etkilerinin yanı sıra hücrelerdeki VEGF sentezine olan etkisi hem transkripsiyonel hem de protein düzeyinde araştırılmıştır.Materyal ve Yöntem: U-87MG ve T98G hücre kültürleri AT-101'in artan konsantrasyonlarıyla (1-50 µM) 72 saat süresince muamele edildi. Hücre canlılığı xCELLigence (Roche) sistemi ile izlendi. U-87MG ve T98G hücre kültürlerindeki apoptoz ELISA yöntemi ve kaspaz ölçümü ile değerlendirildi. Anjiyogenez array ile VEGF ve diğer proanjiyogenik faktörlerin ekspresyonları ölçüldü.Bulgular: Hücre canlılığının sürekli olarak izlendiği deney sisteminde doza ve zamana bağlı etki gösteren AT-101'in, GBM hücre kültürlerindeki sitotoksik etkisi 24. saatte anlamlı şekilde artış gösterdi. AT-101'in U-87MG ve T98G hücre kültürlerindeki IC50 değerleri sırasıyla 2.4 ve 2.7 µM olarak hesaplandı. AT-101'in IC50 dozları ile 24 saat muamele edilen hücrelerin VEGF mRNA düzeylerinde U-87MG hücre hattında kontrole kıyasla 2.7 kat, T98G hücre hattında ise kontrole kıyasla 3 kat azalış belirlendi.Sonuç: Bu çalışmada, U-87 MG ve T98G hücrelerinde AT-101'in, GBM tümörleri için kritik öneme sahip olan VEGF sentezini baskıladığı protein düzeyinde gösterilmiştir. Bu bulgular, AT-101'in, GBM tedavisinde anjiyogenezi baskılamada hem hedefe yönelik tedavide hem de genel tedavi stratejilerinde kullanılabilecek bir ajan olduğunu destekler niteliktedir.

Introduction: Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and worse prognostic glial tumor. Angiogenesis which provides nutrient and oxygen support to proliferating cells play an essential role in GBM development, proliferation and metastasis. The new vessel formation in normal and tumor cells require various signalling pathway activation by the intervention of proangiogenic factors.Vascular endothelial growth factor (VEGF) is one of the main proangiogenic factors. The supression of VEGF synthesis in low grade gliomas prevent these cells progression to higher grade tumors and also might slow down metastasis process. The development of antiangiogenetic agents is a promising treatment issue as blood vessels are essential for vitality of tumor cells.Gossypol is extracted from cotton plant (Gossypium species) and a phenolic aldehyde that permeates cells and acts as an inhibitor for several dehydrogenase enzymes. It is a yellow pigment. AT-101 is -(-) enantiomer of gossypol with further cytotoxicity. Various studies confirmed the antiproliferative effect of AT-101 in different cancer cell lines.In this study, the cytotoxicity effect of AT-101 on GBM cell lines (U-87MG ve T98G) were confirmed and also the impact of this drug on VEGF synthesis on these cell lines were evaluated on. transcriptional and protein levels.Material and Method:U-87 MG and T98 cell lines were treated with increasing concentrations(1-50 µM) of AT-101 for 72 hours. Cytotoxicity was determined by xCELLigence (Roche). Apoptosis was detected by using ELISA and confirmed by caspase assay. VEGF and other proangogenic factors expression were evaluated by angiogenesis array.Results: The cell vitality was constantly followed up in the experiment. The cytotoxicity of AT-101 in both cell lines increased significantly at 24 hours. The IC-50 values of U-87 MG and T98 were 2.4 and 2.7 µM respectively. The VEGF mRNA levels decreased 2.7 fold in U-87MG and 3 fold in T98G by treating these cell lines with AT-101 IC50 dose for 24 hours.Conclusion: This study showed that AT-101 supress VEGF on protein levels at U-87 MG and T98G cell lines and showed AT-101 might be an promising targeted agent in GBM treatment.