Melatonin ve melatonin reseptörlerinin aorta ve HUVEC üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi

Abstract

Zamanla insanlarda pineal bezden salgısı azalan melatonin, serebral ve periferik etkiler gösterdiği gibi vasküler etkiler de göstermektedir. Bu çalışmada melatoninin etkisi melatonin reseptör antagonistleri ile kıyaslanarak ortaya çıkan vasküler cevaplar ve hücre içi yanıtlar sıçan aortu ve Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) hücre dizisi üzerinde değerlendirilmiştir.Bu amaçla sağlıklı erkek albino Wistar sıçanlardan (350-400g), endoteli sağlam torakal aortalar çıkarıldı ve aorta halkaları inkübasyon materyaline göre dört gruba ayrıldı. Birinci grup olan, kontrol grubu aortalara hiçbir inkübasyon yapılmadı. İkinci grup non-selektif MT reseptör agonisti (10-5 M) melatonin (MLT), üçüncü grup nonselektif MT reseptör antagonisti (10-5 M) luzindol (LZL), dördüncü grup (10-5 M) MLT ve (10-5 M) LZL kombinasyonu ile inkübe edildi. İnkübasyon periodunun ardından kümülatif KCl (10-50mM) veya Phe (3x10-9-10-6M) ile elde edilen vazokonstriktif cevaplar, ayrıca Ach (10-10-10-5 M) veya SNP (3x10-9-10-6 M) ile elde edilen vazorelaksan cevaplar kıyaslandı. Veriler iki yönlü varyans analizi ve ardından Bonferroni testi (n:5) (Graph Pad) uygulanarak değerlendirildi. Endotel hücresi deneyleri için ise HUVEC hücre dizisi F12 medyumunda kültüre alındı ve inkübasyon materyaline göre 5 gruba ayrıldı. Birinci grup hiçbir inkübasyon yapılmayan kontrol hücrelerden oluşmaktadır. İkinci grup (10-10-7 M) MLT ile, üçüncü grup (10-10-7 M) MLT ve (10-5, 10-6 M) LZL ile, dördüncü grup (10-10-7 M) MLT ve (10-5, 10-6 M) 4P-PDOT ile, beşinci grup (10-10-7 M) MLT ve (10-5, 10-6 M) GR135531 ile 24 saat inkübe edilmiştir. Bu gruplara daha sonra MTT, kalsiyum miktar tayini ve total nitrat/nitrit miktar tayini yapılmıştır. Sonuçlar kontrole göre yüzde olarak verilmiş, iki yönlü varyans analizi ve ardından Bonferroni testi (n:3) yapılarak değerlendirilmiştir (Graph Pad).(10-5M) MLT inkübasyonu (3x10-7-10-5 M) Phe ve (20mM) KCl ile elde edilen vazokonstrüktif yanıtları anlamlı olarak arttırdı ve bu artış (10-5 M) LZL veya (10-5 M) MLT ve LZL kombinasyonunda görülmedi. Ayrıca 10-5 M MLT, Phe ve KCl eğrilerinden elde edilen EC50 değerlerini belirgin olarak arttırdı, bu sonuçlara uygun olarak 10-5 M LZL ve 10-5 M MLT ve LZL kombinasyonunda bu artış görülmedi. Fakat hiçbir grupta Ach ile elde edilen vazorelaksan cevaplarda belirgin bir değişiklik olmadı. 10-5 M MLT ile inkübasyon (3x10-7 and 10-7 M) SNP ile elde edilen vazorelaksan cevapları artırdı, bu sonuçlara uygun olarak 10-5 M LZL veya 10-5 M MLT ve LZL kombinasyonunda bu artmış cevaplar kontrol seviyelerine kadar azaldı. Melatoninin MT reseptörleri aracılığıyla ortaya çıkan sitotoksik etkileri olup olmadığını anlamak için HUVEC hücre dizisi kullanarak MTT testi gerçekleştirildi. 10-10-3 M MLT hücre canlılığını yüzde olarak belirgin biçimde düşürdü (sırasıyla % 60±4, 66±2, 55±1, 65±1, 64±4). fakat 10-4-10-7 M konsantrasyonlarda ise MLT hücre canlılığını kontrole göre hafif bir şekilde artırdı. 10-2 ve 10-3 M MLT?e 10-5 M LZL or 10-5 M 4P-PDOT eklenmesi hücre canlılığını belirgin olarak artırdı ve kontrol seviyelerine ulaştırdı. Benzer sonuçlar 10-1-10-3 M MLT'e 10-6 M LZL veya 10-6 M 4P-PDOT eklenerek de elde edilmiştir. Buna rağmen MLT (10-10-7 M) ile 10-5 veya 10-6 M GR135531 inkübasyonu, MLT (10-10-7 M)?e göre sitotoksisite üzerinde hiçbir fark ortaya çıkarmamıştır. MLT (10-1-10-7 M) inkübasyonu hücre içi kalsiyum miktarı yüzdesini ise artırdı ve MLT ile 10-5 veya 10-6 M LZL ve 10-5 M veya 10-6 M 4P-PDOT kombinasyonu intraselüler kalsiyum seviyesini belirgin olarak azalttı fakat MT3 reseptör agonisti GR135531 kombinasyonu ise MLT ile kıyaslandığında hücre içi kalsiyum miktarı bakımından hiçbir değişiklik göstermedi. HUVEC hücreleri ile melatonin ve melatonin reseptörlerinin NO üzerindeki etkisini anlamak amacıyla NO miktarının bir göstergesi olan total nitrit/nitrat miktar tayini yapılmıştır. 10-4 mM MLT ile azalan total nitrit/nitrat miktarı, 10-5 M 4P-PDOT veya 10-5 M GR135531 ile birlikte inkübasyon yapıldığında anlamlı artış göstermiştir. 10-5 mM MLT ile 10-5 M luzindol kombine olarak inkübe edildiğinde total nitrit nitrat miktarının 10-5 M MLT?ye göre anlamlı olarak azaldığı görülmektedir. MT reseptörlerinin vasküler etkilerinin değerlendirildiği çalışmaların çoğu ya sıçan kaudal arteri yada sıçan serebral arteri kullanılarak yapılmıştır. Kaudal arter (kuyruk arteri) sıçanda önemli görevler ifa ederken insanda kaudal ater hem çok kısa hem de etkisi çok sınırlıdır, serebral arter ise genel vasküler basıncın bir göstergesi olarak kabul edilmekten uzaktır. Dolayısıyla serebral arter veya kaudal arterde görülen etkilerin, aorta gibi özel fonksiyonları olan damarlarda dahil olmak üzere, bütün damar yataklarında aynı şekilde olması gerekir gibi bir genelleme yapmak doğru olmayabilir. Bu sebepten aortada melatonin ve melatonin reseptörlerinin etkileri ayrıca incelenmelidir. Sıçan torakal aortasında protein ve mRNA seviyesinde yanlız MT1 reseptörü bulunması; bu reseptörlerin de endotelde (Tunica adventitia) yoğunlaşması sebebiyle, bu çalışmada 10-5 M MLT, KCl veya Phe ile elde edilen vazokonstriktör cevaplar ve SNP ile elde edilen vazorelaksan cevaplar, endoteli sağlam aortada MT1 reseptörü aracılığıyla ortaya çıkmaktadır. HUVEC kullanarak elde ettiğimiz sonuçlar ise 10-10-3 M MLT'in daha çok MT2 reseptörleri aracılığıyla olmak üzere MT1/MT2 reseptörleri üstünden sitotoksik etkiler ortaya çıkardıkları sonucuna ulaşılmıştır. Ayrıca MLT hücre içi Ca2+ seviyelerini MT1/MT2 reseptörleri aracılığıyla artırmaktadır, MT3 reseptörü ise hücre içi Ca2+ miktarına etki etmemektedir. Total nitrit nitrat miktarı ölçülerek yapılan deneylerden elde edilen sonuçlara dayanarak MLT?nin HUVEC hücrelerinde NO miktarını baskıladığı ve bu etkiyi başlıca MT2 reseptörleri aracılığıyla yaptığı sonucuna ulaşılmıştır.Anahtar Kelimeler: Melatonin, melatonin reseptörleri, HUVEC, aorta, vazoreaktivite, nitrik oksit, kalsiyum, sitotoksisite.

Melatonin which its secretion from pineal gland decreases gradually in human, has not only interserebral and pheripheral impacts but also has vascular effects. In this study the vascular responces and intracellular mechanisms of melatonin were evaluated by comparing melatonin and melatonin receptor antagonists using rat aortae and HUVEC cell line.For this purpose we extracted the thoracal aortae of healhty male Wistar albino rats (350-400g) which has intact endothelia. We divided the aortic rings into four groups due their incubation material. 1st group was control aortae without any incubation, 2nd group was incubated in nonselective MT receptor agonist 10-5 M Melatonin (MLT), 3rd group was incubated in nonselective MT receptor antagonist 10-5 M Luzindol (LZL), 4th group was incubated in combination of 10-5 M MLT and 10-5 M LZL. After the incubation period, we evaluated the vasoconstrictive responces of cumulative potassium chlorure (KCl;10-50mM) or phenylephrine (Phe; 3x10-9-10-6M) and vasorelaxant responces of cumulative acetylcholine (Ach; 10-10-10-5 M) or sodyum nitroprussid (SNP; 3x10-9-10-6 M). Data were analysed by using two way ANOVA and Bonferroni Post Test (n:5) (Graph Pad). For endothelial experiments HUVEC cell line was cultured in F12 medium, and then, was divided into 5 groups depending on the incubation material: 1st group was control HUVECs without any incubation, 2nd group incubated in (10-10-7 M) MLT, 3rd group incubated in (10-10-7 M) MLT and (10-5 or 10-6 M) LZL, 4th group incubated in (10-10-7 M) MLT and (10-5or 10-6 M) 4P-PDOT, 5th group incubated in (10-10-7 M) MLT and (10-5 or 10-6 M) GR135531 for 24 hours. Then MTT, calcium assay and total nitrate/nitrit assays were carried out using these groups. Results were compared by using two way ANOVA and Bonferroni Post test (n:3) (Graph Pad).The vasoconstrictive responses of (3x10-7-10-5 M) Phe and (20mM) KCl were increased significantly by incubation of 10-5 M MLT and this increase was not observed by incubation of 10-5 M LZL or combination of 10-5 M MLT and 10-5 M LZL . Also, the EC50 values of KCl and Phe curves inreased significantly in the presence of 10-5 M MLT, in accordance with that, not in the presence of 10-5 M LZL or combination of 10-5 M MLT and 10-5 M LZL . But, there were no significant changes on vasorelaxant responces of Ach in any group. Incubation of 10-5 M MLT increased the vasorelaxant responses of (3x10-7 and 10-7 M) SNP in accordance to that 10-5 M LZL or both combination of 10- 5 M MLT and 10-5 M LZL reduced these increased responses to control levels. We performed MTT test on HUVEC cell line to find out if these is MT receptor-mediated cytotoxic effects of MLT. 10-0,001 mM concentrations of MLT reduced the percentage of cell viability significantly (60±4, 66±2, 55±1, 65±1, 64±4 %, respectively) but 10-4-10-7 mM concentrations of MLT slightly increased the percentage of cell viability compared to control cells. 10-5M LZL or 10-5M 4P-PDOT addition to 0,01 and 0,001 mM MLT increased the percentage of cell viability significantly to control levels. Similar results were obtained when 10-6 M LZL or 4P-PDOT were added to 0,1-0,001 mM MLT. However, incubation of (10-5 or 10-6 M) GR135531 with MLT (10-10-7 mM) did not make any difference when compared to only MLT. We have also observed that MLT (0,1-10-7 mM) incubation increased percentage of intracellular calcium (Ca2+) concentration and 10-5 M or 10-6 M LZL or 10-5 M or 10-6 M 4P-PDOT reduced intracellular Ca2+ levels significantly, but MT3 receptor agonist GR135531 did not exhibits any change when its compared to MLT.HUVEC were used to evaluate the effects of melatonin and melatonin receptors on NO production by total nitrite/nitrate amount assay. The reduction of total nitrite/nitrate amount by 10-4 mM MLT were increased by combined incubation of 10-5 M 4P-PDOT and 10-5 M GR135531. 10-5 mM MLT and 10-5 M luzindole incubation total nitrite/nitrate amount were reduced when it was compared with 10-5 mM MLT.Most of the studies that evaluate the vascular effects of MT receptors have done by using either rat caudal or cerebral arteries. It seems likely to oversimplify generalizing these effects to all blood vessels. In conclusion, 10-5 M MLT was increased the vasoconstrictive responces of KCl or Phe and the vasorelaxant responces of SNP through MT1 receptors in endothelium intact rat aortae.These data indicates that 10-10-3 mM MLT exhibits cytotoxic effects through MT1/MT2 receptors. Also MLT increased the intracellular Ca2+ levels through MT1/MT2 receptors. MLT was increased intercellular Ca2+ concentration by MT1/MT2 receptors but MT3 receptor did not change intercellular Ca2+ concentration. Due to the results that we got from the total nitrite nitrate assays, MLT slightly decreased NO by using MT2 receptors.Key Words: Melatonin, melatonin receptors, HUVEC, aortae, vasoreactivity, nitrik oksit, calcium.