Observable real-time pulsed-field gel electrophoresis

Abstract

Değişken Alanlı Jel Elektroforezi (DAJE), veya (Pulsed Field Gel ElectrophoresisPFGE) çok büyük DNA moleküllerini birbirinden ayırmak için kullanılan çok önemlibir moleküler araştırma ve tanı tekniğidir. Birbirine çok benzeyen genomlardaki azsayıda dizi farklılıklarını kolayca ayırt edebilen DNA parmak izi incelemesi yönteminingeliştirilmesini sağlamıştır. Bu yöntemde, bir restriksiyon enzimi ile büyük DNAparçalarına bölünen hücre genomu DAJE ile ayrıştırılarak incelenir. Parmak izi incelemesiadli tıpta babalık testi, suçlunun saptanması gibi amaçlarla kullanılırken, enfeksiyonhastalıklar alanında moleküler epidemiyolojinin gelişmesini sağlamıştır. Salgınayol açan enfeksiyon etkeninin çeşitli örneklerden elde edilen suşlarına uygulanan parmakizi incelemesi ile enfeksiyon kaynağı ve yayılma yolları saptanabilmektedir. Birsalgının hastanede, bir ülkede hatta dünyada yayılmasını bu yolla izlemek salgına engelolmak için gerekli önlemleri almak açısından büyük önem taşımaktadır. Bu dereceönemli ve güçlü bir teknik olan DAJE maalesef uygulaması zor olan, uzun zaman alan,iyi eğitimli çalışan ve pahalı aygıtlar gerektiren bir teknik olduğundan yaygın olarakkullanılamamaktadır.Dört yıl önce tamamlanan TÜBİTAK tarafından desteklenen bir proje çerçevesindegeliştirilen İzlenebilir Elektroforez adı verilen bir yöntem ve bu yöntemin uygulanmasınısağlayan bir aygıt, Türk Teknoloji Geliştirme Vakfı tarafından Akın Çakmakcı,sanayiye uygulanan tez çalısması ödülünü almıştı. Bu tez çalısmasında ise İzlenebilirElektroforez adını verdiğimiz bir yöntem ve bu yöntemin uygulanmasını sağlayan biraygıt geliştirilmiştir. Bu yöntemin etkinliğini saptamak için, hastane enfeksiyonunasebep olan bakteri ve maya suşlarının sonuçları klasik DAJE ve İzlenebilir DAJE ilekarşılaştırıldı. İzlenebilir DAJE'nin, klasik DAJE'ye göre araştırmacılara çok zamanve emek artırımı sağlayabileceği görüldü. İzlenebilir Elektroferezin kullanılabilmesi,klasik DAJE de kullanılması zorunlu olan zararlı ultraviyole ışığı ve kansorejen etidyumbromür kullanımını da ortadan kaldırabilecektir. Elektroforezin her basamaığında fotoğrafçekilebilmesini sağlayan izlenebilir DAJE, sonucu analiz etmek için seçilebilecek en uygunfotoğrafın kullanıcı tarafından belirlenmesine olanak tanıyor, ve bu yolla eğer butez çalışmaları ile uygulanabilirliğini göstermeye başardığımız sistemin gelişimi ve genişdenemeleri tamamlanabilirse, klasik DAJE ile karşılaştırıldığında, çok fazla zaman veefor kazanımı sağlayabilecektir.

Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) is a very important molecular researchand diagnostic technique, used for the separation of very large DNA molecules. Itenables DNA fingerprint analysis which can differentiate small number of sequence differencesin genomes belonging to the same species. In this method the genome digestedfirst by a restriction enzyme into large DNA fragments analyzed by PFGE. While DNAfingerprinting is used in forensic medicine for identifying the suspects or paternity, itenabled also the development of molecular epidemiology of infectious diseases. It ispossible to identify the source and transmission routes of an epidemic by DNA fingerprintingof the strains of infectious agent isolated from a series of samples. It is veryimportant to follow the transmission routes of the infectious agent in a hospital, countryor even around the world, in order to take the precautions to stop the epidemic.Although DNA fingerprinting by PFGE is a very important and powerful technique,its application is very cumbersome, requires long time, experienced personnel and expensiveequipment. These hinder the method from being widely used.In a project that was completed four years ago, a method and an instrumentcalled `Observable Real Time Electrophoresis (ORTE)` was developed and it won theAkın Cakmakci Award, of Turkish Technology Development Foundation. In this thesiswork the aim is to develope an Observable Real Time PFGE system. Its efficiency isevaluated by comparing the genomic fingerprints of bacterial and fungal strains thatwere previously isolated from hospital infections by Observable and classical PFGE.Observable PFGE has the potential to eliminate the need for hazardous ultraviolet lightand carcinogen ethidium bromide. It provided pictures at every stage of electrophoresisenabling to choose the best picture for analysis of the results. Since Observable PFGEenables to see the results early during electrophoresis we believe that compared toclassical PFGE, it could save a lot of time and effort, in many diverse applications,once the system that we present the technological feasibility in this thesis work, isdeveloped and tested further.