In vitro studies of carboxymethyl cellulose/gelatin and calciumphosphate/calcium sulfate cement based composites for bone tissue engineering

Abstract

Bu çalısmada kemik doku mühendisligi için kalsiyum fosfat (CPC) ve kalsiyumsülfat bazlı seramik, karboksimetil selüloz (CMC), jelatin (Gel) ve sitrik asitten (CA)olusan hidrojelle karıstırılmıstır. Kemik doku mühendisliginde kemigin yapısında bulunanorganik kolajen ve inorganik hidroksiapatit (HA) kristalleri taklit edilir. Birçokçalısmada, HA'in düsük çözünürlügü ve sekil alma zorlugu sebebiyle tetrakalsiyumfosfat (TTCP) ve dikalsiyum fosfat dihidrat (DCPD) gibi kalsiyum fosfat seramikleridirek olarak hidroksiapatit kullanmak yerine tercih edilir. Kalsiyum sülfat dihidrat(CSD) da sertlesme süresini ve çözünme karakteristiklerini kontrol etmek amacıyla kullanılır.Toz kısımla karısan polimerler kemigin organik yapısını taklit etmeye yararlarve CPC'lerin çözündükten sonraki olası zararlı etkisini önlerler.Bu çalısmada selülozunçözülebilir bir türevi olan CMC, CA ile esterifikasyona ugrayarak hidrojel formunagelmistir. Gel ise hücresel tutunmayı ve kompozitin mekanik gücünü artıran bir kolajentürevidir. Burada, 2 w/v% CMC, 20 wt% CA ve 10 wt% Gel ile karıstırılaraksıvı fazı olusturmustur. Daha sonra, TTCP katı-hal reaksiyonu ile üretilip 76.65 %TTCP, 23.35% DCPD ile karıstırılmıstır. Bu karısım, totalde 20% CSD olacak sekildebir araya getirilmistir. Birlestirilen sıvı ve katı faz, bir sırınga içinde 50oC de 72saat kalıplandırılmıstır. Kompozitlerin morfolojileri sertlestikten sonra ve PBS içindeinkübe edildikten sonra Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile incelenmistir. Kompozitlerinfiziksel karakteristikleri PBS içinde 37oC'de inkübe edildikten sonra, sisme,çözünme ve pH çalısmaları ile arastırılmıstır. Hücre kültürü çalısmaları kemik iligindenelde edilen mezenkimal kök hücreler ile (BMDMSC) yapılmıstır. Hücre canlılıgıdirek kontak metodu kullanılarak Alamar Mavisi testi ile hesaplanmıstır. Son olarakhücre yapısması tekrar SEM kullanılarak gözlenmistir. Sonuçlar P62.5 ve P65 kompozitlerininhomojen yapısını ve tüm kompozitlerin mikroporlu yapısını göstermistir.Sisme-çözünme testine göre P70 hariç bütün kompozitler aynı sisme-çözünme egilimini göstermistir. 72 saat sonunda toz oranı arttıkça sisme oranı düsmüstür. Toz oranıve çözünme ise ters orantılıdır. pH çalısması göstermistir ki ilk 8 saat toz kısmın ilkçözünmesi sebebiyle pH 12 civarındadır, 72 saat sonunda fizyolojik degere yakın olan7'ye ulasmıstır. Hücre canlılıgı hesaplanmıs ve yalnızca P65 için 1-3 ve 14. günlerdeönemli bir düsüs görülmüstür. Totalde, kompozitler basarıyla üretilmistir ve sonuçlaragöre kemik doku mühendisligi için biyouyumluluk yönünden potansiyelleri vardır.

In this study, a calcium phosphate (CPCs) and calcium sulfate-based cementwas introduced into carboxymethyl cellulose (CMC)-gelatin (Gel) and citric acid (CA)hydrogel for bone tissue engineering. Bone tissue is composed of organic collagen andinorganic hydroxyapatite (HA) crystals which are mimicked in bone tissue engineeringapproach. In many studies, CPCs such as tetracalcium phosphate (TTCP) and dicalciumphosphate dihydrate (DCPD) are used instead of directly using HA due to lowsolubility and difficulty of shaping of HA. Calcium sulfate dihydrate (CSD) is also usedto control setting and degradation characteristics of the cement. Polymers which aremixed with the powder phase provides a composite material that mimics the organicphase of the bone tissue and prevents potential toxic effect of CPCs degradation. Inthis study, CMC which is a soluble cellulose derivative became a hydrogel by esterificationwith CA. Gelatin is a collagen derivative which provides cellular attachment andmechanical strength to the composite. In here 2 w/v% CMC was mixed with 20 wt%CA and 10 wt% Gel to obtain the liquid phase. After that, TTCP was synthesizedwith solid-state reaction and 76.65% of TTCP was mixed with 23.35% of DCPD. Thismixture was blended with 20 % of CSD in the total powder phase. Combined liquidand powder phases were molded in a syringe and set at 50C for 72h. Morphology ofthe composites were examined after setting and incubation in PBS by using ScanningElectron Microscopy (SEM). Physical characteristics of the composites were investigatedwith swelling, degradation and pH studies after incubation in PBS at 37C.Cell culture studies were performed with bone marrow-derived mesenchymal stem cell(BMDMSCs). Cell viability was measured with direct contact method with AlamarBlue assay. Finally, in vitro cell adhesion was observed again by using SEM. The resultsindicated the homogenous structure of P62.5 and P65 and micropores in all composites.According to swelling-degradation results, except for P70, all the composites had thesame swelling-degradation trend. At the end of 72h, when powder ratio was increased,the swelling degree was decreased. The powder ratio and degradation were inverselyproportional. pH study showed that at first 8 hours, pH was around 12 because of theinitial degradation of powder phase, at the end of 72h it reached around 7 which issimilar with the physiological value for all composites. Cellular viability was calculatedand only significant decrease was observed for P65 between 1-3 and 14 days. Overall,composites were successfully produced and according to results they had a potentialfor bone tissue engineering in terms of their biocompatibility.