İnsan plasentasında fibronektin ve matriks metalloproteinazlarının dağılımı: Doku düzenlenmesi ve trofoblast invazyonu açısından rolleri

Abstract

Ill ÖZET Maternal dokuların invazyonu esnasında fetal trofoblast hücreleri tümör matrikslerine benzeyen bir matriks (matriks-tip fibrinoidi) salgılar. Bu matrikste bulunan fibronektin izoformlarının (Fni) ve matriks metalloproteinazlarının (MMP) trofoblast invazyonu esnasında önemli roller oynadıkları düşünülmektedir. Ayrıca yine bu matrikste yer alan ve `i` kan grubu antijenini taşıyan fibronektin benzeri küçük moleküllerin, annenin immun cevabını suprese ettikleri yönünde spekülasyonlar vardır. Bu çalışmanın amacı maternal ve fetal dokular tarafından plasentasyon esnasında üretilen diğer matriksler ile trofoblast matriksi arasındaki farklılıkların ortaya konmasıdır, özellikle ekstraselüler matrikslerde Fni ve MMP'larının dağılımlarına odaklanılmıştır. Ayrıca `i` kan grubu antijenini taşıyan küçük fibronektin benzeri moleküllerin matriks-tip fibrinoidinden izolasyonu ve karakterizasyonu hedeflenmiştir. İnsan term plasentasının farklı bölgelerinden örnek dokular toplanmıştır ve immunohistokimyasal yöntemler kullanılarak, Fni (genel, hücresel ve onkofetal) ve MMP (MMP-2, -3, -9) belirlenmiştir. Ayrıca bu dokulardaki matriks elemanları çok basamaklı bir protokol ile ekstrakte edilmiştir. Fni varlığı SDS-PAGE ve Western blot, MMP aktiviteleri de jelatin substratlı SDS-PAGE (zimografi) yöntemleri ile gösterilmiştir. Elde edilen sinyaller dansitometrik ölçümler olarak taranmış ve değerlendirilmiştir. Fetal membranlardan hazırlanan ekstraktlarda ufak fibonektin benzeri olan `i` kan prekürsör antijenini taşıyan proteinler jelatin-agaroz kolon kromatografisi ve afinite kromotografileri ile ayrıştırılmaya çalışılmıştır. Hemen hemen çalışılan tüm örnek dokularda farklı Fni ve MMP'na ait reaktivite ve aktiviteler saptanmıştır. Bu moleküller değişen oranlarda ve beraber ekstrakte edilebilmişlerdir. Hücresel ve onkofetal fibronektinler, ve MMP-2 için en güçlü reaksiyonlar özellikle trofoblastların, maternal dokuları invaze ettikleri bölgelerde bulunmuştur. Ayrıca MMP-9'un verdiği en yüksek enzimatik aktiviteler fetal ve maternal dokuların temas noktalarında belirlenmiştir. Bu MMP'ın doğum esnasında plasentanın uterus duvarından ayrılmasındaki rolüne işaret etmektedir, `i` kan grubu antijenini taşıyan küçük fibronektin benzeri moleküllerin biyokimyasal izolasyonu ve pürifikasyonunda kullanılan yöntemlerle elde edilen verilerin anlamlılıkları spesifite açısından tartışılarak, literatürde rapor edilen sonuçların gerçeği ne ölçüde yansıttıkları yorumlanmıştır. Anahtar kelimeler: plasenta, ekstravillöz trofoblast, invazyon, ekstraselüler matriks, fibronektin, metalloproteinaz

IV ABSTRACT During the invasion process, trophoblast cells secrete a tumor-like matrix (matrix-type fibrinoid). Fibronectin isoforms (Fni) and matrix metalloproteinases (MMP) that are present in this matrix, seem to play an important role during trophoblast invasion. Besides, there are speculations that small fibronectin like molecules carrying antigenic epitope of `i` blood precursor supress the immune system of the mother. The aim of the present study was to analyze the differences between the other types of matrices produced by maternal and fetal tissues and the tumor-like matrix produced by trophoblast. The main concern was focused on the distribution of Fni and of MMP in the extracellular matrices. On the other hand, it was also aimed to isolate and characterize small fibronectin like molecules carrying antigenic epitope of `i` blood precursor. Tissue samples were collected from different sites of human term placenta By using immunohistochemistry the expression of Fni (general, cellular and oncofetal) and MMP (MMP-2, -3, -9) were determined. Besides, matrix components of these tissues were extracted with a multi-step extraction protocol. The presence of Fni were demonstrated by SDS-PAGE and Western blots and the activities of MMP were demonstrated by gelatine- substrated SDS-PAGE (zymography). The signals from immunoreactivities and enzymatic activities were detected by scananalytics system. The extractions from fetal membranes were applied on gelatine agarose and affinity columns to isolate and purify the small fibronectin like molecules carrying antigenic epitope of `i` blood precursor. In nearly all tissues reactivities and activities for Fni and MMP were determined. These molecules were co-extracted from all tissues in variable degrees. Strongest reactivities for cellular and oncofetal fibronectins and strongest enzymatic activity for MMP-2 was found, in particular, in areas where invasive fetal trophoblast cells invade maternal tissues. MMP-9 was found to have the highest enzymatic activity in the deepest part of human placenta at the contact region of fetal and maternal part, suggesting the importance of MMP-9 in the separation of placenta from uterine wall during the labor.The results obtained during the isolation and purification of small fibronectin like molecules carrying antigenic epitope of `i` blood precursor were discussed regarding to their specificity and their relevance reported in the literature. Keywords: placenta, extravillous trophoblast, invasion, extracellular matrix, fibronectin, metalloproteinase