Fetal, neonatal, puberte ve erişkin fare testisinde PARP-1, PARP-2 VE PAR ekspresyonlarının araştırılması

Abstract

İnsanda ve farede oldukça benzer olan testis gelişimi, somatik hücrelerin etkisiyle gerçekleşen ve hücre farklılaşması, apoptoz, mitoz ve mayoz bölünmeler gibi önemli biyolojik olayları içeren bir süreçtir. Germ hücrelerinin ve onların destek hücreleri olan Sertoli hücrelerinin fetal ve neonatal dönemlerdeki normal gelişimleri, yetişkin erkek üreme fonksiyonlarını belirlemektedir. Diğer bir deyişle, testis gelişimindeki morfolojik ve hücresel olayların düzenlenmesi, yetişkin testis özelliklerinin kazanılması için gereklidir. Poli ADP-ribozilasyon (PARlasyon), Poli ADP-riboz Polimeraz (PARP)'lar tarafından katalizlenen ve DNA zincir kırıklarıyla aktive olan hücresel bir cevaptır. PARP-1, PARP ailesinin en iyi tanımlanmış üyesidir. Erişkin testiste; PARP-1'in ve Poli ADP-riboz (PAR) polimerlerinin spermatogenik hücrelerdeki dağılımı ve germ hücre farklılaşmasında PARlasyonun rolü gösterilmiştir. PARlasyon, hedef proteinlere PAR polimerleri ekleyip onların aktivitesini düzenleyen bir postranslasyonel modifikasyondur. Ayrıca, PARP-2'nin spermatosit mayoz bölünmeleri ve spermiyogenezdeki anahtar rolü, PARP-2 geni silinmiş farelerin hipofertil olmaları ile kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, erişkin testisteki rollerinden yola çıkarak, PARP-1, PARP-2 ve onların ürünü olan PAR polimerlerinin; fetal, neonatal, pubertal testislerdeki ekspresyonları değerlendirilmiştir.Embriyonik (E) 15.5, E17.5, doğum sonrası (DS) 0, DS3, DS5, DS9, DS15, DS20 ve erişkin testis dokuları parafin bloklarından alınan seri kesitlere; PARP-1, PARP-2 ve PAR'ın dağılımlarını incelemek amacıyla immünohistokimya uygulanmıştır. Bunlara ek olarak; germ hücrelerin belirtilmesi için VASA (MVH), puberte öncesinde henüz farklılaşmamış pre-Sertoli hücrelerini göstermek için Anti-Müllerian Hormon (AMH) antikorları kullanılmıştır.PARP-1; E15.5, E17.5 ve PP0 günlerinde gonositlerde gözlenmiştir. PP3.günde; seminifer tübülün bazaline göç eden gonositlerde ekspresyonu devam etmektedir. PP5.günde; tübülün bazaline göç ederek spermatogonyumlara farklanan gonositlerde ekspre olmaktadır. PP9, PP15 ve PP20.günlerde spermatogonyumlarda, erişkin testis dokusunda ise; spermatogonyumların yanısıra intersitisyel alandaki hücrelerin nükleuslarında varlığı gösterilmiştir. PAR ekspresyonu, E15.5, E17.5, DS0, DS3, DS5, DS15, DS20. günlerde pre-Sertoli hücrelerinde gözlenirken, DS9. günde testiste PAR ekspresyonu görülmemiştir. Erişkinde ise; spermatogonyumlarda ve intersitisyel alandaki hücrelerin nükleuslarında PAR ekspresyonu gözlenmiştir. PARP-2 ekspresyonu; E15.5, E17.5, DS0, DS3. günlerde gonositlerde izlenirken DS5.günde spermatogonyumlarda görülmemiştir. DS9, DS15 ve DS20. günlerde PARP-2 ekspresyonu, spermatogonyumlarda ve spermatositlerde izlenmiştir. E15.5, E17.5 ve DS0-DS20. günlerde, Sertoli hücrelerinde ekspresyonu devam eden PARP-2, erişkinde ise; Sertoli sitoplazmasında, spermatositlerde ve uzayan spermatidlerde gözlenmiştir.Bu çalışmada; PARP-1, PARP-2 ve PAR'ın testis gelişim sürecinde somatik ve germ hücrelerindeki ekspresyonları ilk defa gösterilmiştir. Sonuçlarımız, erişkinde erkek fertilitesi için önemli olduğu bildirilen bu moleküllerin, embriyonik ve pre-pubertal testis gelişiminde de rolleri olabileceğini ortaya koymaktadır.Anahtar Kelimeler: Fare testis gelişimi, PARP-1, PARP-2, PAR, immünohistokimya

Development of testis, a process that is highly similar between humans and mice, occurs under the influence of somatic cells and involves important biological events such as; differentiation, apoptosis, and meiotic/mitotic cell divisions. Thus, processes during the fetal and neonatal periods contributing to the development of germ cells and Sertoli cells that constitute the major supportive matrix, determine adult male reproductive function. In other words, regulation of morphologic and cellular events is required for acquiring the characteristic properties of mature testis. It has been demonstrated that in the adult testis, within the spermatogenic cells, PARP-1 protein and PAR polymers are expressed and play an important role in differentiation of germ cells. In addition, it is thought that PARP proteins might be involved in maintenance of genomic integrity in adult spermatogenic cells. Furthermore, PARP-2 has been implicated in abnormal spermatogenesis. In a recent study, PARP-2 deficient male mice were found to have hypofertility and the decrease in fertility seen in these PARP-2- null mice could be related to both defective meiosis I and spermiogenesis. Taken above into account, we evaluated the expressions of PARP-1 and PARP-2, together with their end-product PAR polymers during mouse testis development.Immunohistochemistry was performed for PARP-1, PARP-2 and PAR antibodies that were applied to paraffin sections of embryonic (E) 15.5, E17.5, doğum sonrası (PP) 0, PP3, PP9, PP15, PP20 and adult testis tissues. In addition, VASA (MVH) and Anti-Müllerian hormone (AMH) antibodies were used for defining germ cells and for determining undifferentiated pre-Sertoli cells, respectively.PARP-1 was seen in gonocytes at E15.5, E17.5, and PP0 days. At day PP3, the expression was present in gonocytes that migrate to the basal membrane of tubules and also in pre-Sertoli cells. At day PP5, PARP-1 expression was observed in differentiated spermatogonia. At day PP9, PP15, PP20 PARP-1 was seen in spermatogonia and in adult testis tissue the expression was in spermatogonia and interstitial area cells. PAR expression on days E15.5, E17.5, PP0, PP3, PP5, PP15 and PP20 was present in pre-Sertoli cells. On days PP9, there was no PAR expression. In adult testis tissue, PAR expression was observed in spermatogonia and interstitial area cells. PARP-2 expression was present in gonocytes at days E15.5, E17.5, PP0, and PP3. On day PP5 it wasn?t seen in spermatogonia. PARP-2 immunlocalization was seen in spermatocytes at days PP9, PP15, and PP20. On days E15.5, E17.5, and PP0-PP20, PARP-2 was localized to Sertoli cells. In adult testis tissue, PARP-2 expression was present in spermatogonia, spermatocyes and in elongated spermatids.Our study for the first time has demonstrated the distributions of PARP-1 and PARP-2 during testicular development in mice. Our findings provide evidence that PARP proteins may have roles during both embryonic and prepubertal testis development, in addition to their key roles in adult male fertility.Key Words: Mouse testis development, PARP-1, PARP-2, PAR, immunohistochemistry