Desert Hedgehog sinyal yolağının anormal spermatogenez ve testiküler kanser oluşumundaki rolünün araştırılması

Abstract

Hedgehog (Hh) sinyal yolağı, birçok dokunun gelişimi sırasında düzenleyici olarak rol oynamakta ve bazı kanser türlerinde ekspresyonları artmaktadır. Hh sinyalinin, çeşitli kanser türlerinin oluşumunda katkı sağladığı kabul edilmesine rağmen, bu yolağın testis gelişimindeki rolü, yetişkin testisinde spermatogoniyal kök hücrelerdeki ekspresyonu ve spermatogenezdeki rolü henüz bilinmemektedir. Embriyonik gelişim sırasında, olgunlaşmasını normal olarak tamamlayamayan germ hücrelerinin, yetişkinlik döneminde testis kanseri ile ilişkilendirilmesinden dolayı, bu tez çalışmasında Hh'ların, normal gelişmekte olan testiste ve testis gelişiminin hasara uğradığı durumlarda, yetişkin testisindeki spermatogoniyal kök hücrelerde ve normal yetişkin spermatogenezindeki rolleri sorgulandı. Bu amaçla, Desert Hedgehog sinyal yolağının anormal spermatogenez ve testiküler kanser oluşumundaki rolü, in situ hibridizasyon, immünohistokimya, tübül damla kültürü ve qRT-PCR yöntemleriyle araştırıldı.Çalışmamızın sonuçları, spermatogenezin ilk dalgasında, Hh sinyal yolağının, erken embriyonik germ hücrelerinde aktivite gösterdiğini, doğum sonrası dönemdeki germ hücrelerinde sinyal aktivitesinin kaybolduğunu ve yetişkinlik döneminde, spermatogenezle beraber, Hh sinyalinin tekrar aktifleştiğini gösterdi. Radyasyona maruz kalan yetişkin sıçan testisi modeli kullanarak yaptığımız analizler sonucunda, Hh sinyal yolağının, yalnızca embriyonik dönemdeki testiküler kök hücrelerde değil ancak, yetişkin sıçan testisindeki farklılaşmamış spermatogoniyal kök hücrelerde de aktivite gösterdiği bulundu. İlginç olarak, hormonal çevrenin değişmesiyle birlikte, kök hücrelerin bir sonraki aşamaya farklılaşmasıyla Hh sinyalinin de aktivitesini yitirdiği gözlendi.Dibütilfitalat maruziyeti veya aktivin beta-A geninin knock-out edilmesiyle, embriyonik testis gelişiminin hasara uğradığı durumlarda, Hh sinyalinin ekspresyon şiddetinin de değiştiği gözlendi. Bu durum, anormal germ hücre gelişiminde, Hh sinyal yolağının da katkı sağlayabileceğini gösterebilir.Seminifer tübül damla kültürü yöntemiyle, Hh sinyal yolağı aktivitesinin, Hh inhibitörü olan Cyclopamine ile inhibe edilmesinin ardından, postnatal 1 günlük testiste, SCYP3 ve Stra8 gibi mayoz ilişkili genlerin up-regüle olduğu bulundu.Kemirgen testis dokularında, germ hücre gelişiminin özel aşamalarında rol oynadığı gösterilen Hh sinyal yolağının, insan testiküler kanserli dokularında da aktivite gösterdiği anlaşıldı.Bu tez çalışmasında bildirilen, Hh'ların gelişim farklı aşamasındaki testiküler hücrelerdeki ekspresyonlarıyla ilgili bilgiler, Hh sinyalinin, spermatogenezin özel basamaklarında aktif olduğunu ve çok sıkı bir şekilde denetlenerek, spermiogenezle kapandığını göstermektedir. Testis gelişim ve fonksiyonu sırasında bu derece kritik olan ve sıkı bir şekilde denetlenen Hh sinyal yolağında meydana gelebilecek herhangi bir hasarın, anormal spermatogenezle sonuçlanabileceği ve dahası testisküler kanser oluşumuna katkı sağlayabileceği söylenebilir.Anahtar Kelimeler: Desert Hedgehog sinyal yolağı, spermatogenez, testiküler gelişim, in situ hibridizasyon.

Hedgehog (Hh) signalling regulates many aspects of normal development and is upregulated in some cancers. Although the contribution of Hedgehog signalling to cancers is widely accepted, its importance for testis development, spermatogonial stem cells, a unique pluripotent cell type sustained through adulthood, and its roles in spermatogenesis are unknown. Because it is hypothesised that the germ cells which couldn?t mature properly during embriyonic life are associated with testicular cancer in adult life, this thesis aimed to clarify the contribution of Hedgehog signalling in abnormal spermatogenesis and testicular cancer by using in situ hybridisation, immunohistochemistry, tubule drop culture and qRT-PCR techniques..The results of our study showed that during the first wave of spermatogenesis, Hh signaling pathway is active in germ cells, disapearing at birth and reactivating with spermatogenesis in adults. The results from irradiated rat testis model showed that Hh signalling is not only active in embryonic spermatogonial stem cells but also in adult stem cells in the testis. These findings provide the first indication that Hh signalling is active in resting stem cells and are turned off when stem cells mature.When embryonic testis development is disturbed by using DBP exposure and Activin ? -A knock-out models, we observed that the activity of Hh signalling has been changed. This suggests the possible contribution of Hh signalling in abnormal germ cell development.By using a hanging drop culture system on postnatal day 1 mouse seminiferous cords with or without Cyclopamine, (an inhibitor of the Hh signalling pathway), we showed that the genes associated with meiotic divisions such as Stra8 and SCYP3 are upregulated.As well as the expression sites of Hh signalling in murine testis shown in this study, we also understand that Hh signalling is active in testicular cancer patients samples.This thesis provides fresh information regarding Hh signalling which demonstrated that Hh pathway component expression is highly regulated in the testis, indicating that Hh signals function at discrete stages of spermatogenesis. The data presented in this thesis provide a new understanding of how Hh signalling is regulated in vivo and demonstrate its potential contribution to male fertility and infertility. As our understanding of the number of cancers associated with Hh signalling increases, understanding the mechanisms by which Hh signal transduction is regulated is essential for identifying potential target drugs and developing new treatments.Key Words: Desert Hedgehog signalling pathway, spermatogenesis, testicular development, in situ hybridization.