Tümör progresyonunun önlenmesi için prostat kanseri hücrelerinde, PKC? ve PKC?`nun CDME tarafından kontrolü

Abstract

Prostat kanserinin moleküler temeli, tümör baskılayıcı pro-apopototik bir protein olan PKC?'nın inaktivasyonu ile ve büyümeyi indükleyen onkojenik bir protein olan PKC?'nın aktivasyonu ile kuvvetle ilişkilidir. Çünkü kanserde bozulan oksidatif şartlar, sisteince zengin olan her iki PKC izozimini öncelikli olarak hedef alarak yapılarında değişikliğe neden olur. Tiyol antioksidanların disülfid formları, S-sisteinilasyon mekanizması aracılığıyla (PKC-S-S-Cys) PKC izozimleri ile ilişkiye girerek aktivitelerinde belirgin değişikliklere yol açar. Çalışmamızda, sistinin metabolik bir prekürsörü olan sistin dimetil estere (CDME) cevaben gelişen PKC? ve PKC? oksidatif regülasyonunun farklı prostat kanseri hücrelerinde incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, kontrol hücresi olan RWPE-1'de (nontümörijenik prostat epitelyum hücre dizisi) ve prostat kanser hücreleri olan LNCaP'de (androjen-bağımlı prostat kanseri hücre dizisi) ve PC3'de (androjen-bağımsız prostat kanseri hücre dizisi); ileri analizler için uygulanacak CDME dozunu seçmek amacıyla WST-8'in formaza indirgenmesi temeline dayanan hücre sitotoksisite deneyi, CDME muamelesini takiben hücre içi sistin düzeylerini ölçmek için radyoaktif sistin bağlayıcı protein (CBP) analizi, CDME-indüklü apoptozisi değerlendirmek için DNA fragmantasyonu ve Kalsein-AM deneyleri, PKC? ve PKC? enzim aktivitelerini tayin etmek için nonradyoaktif analiz ve protein ekspresyonlarını göstermek için ise western blot deneyleri yapıldı. Bulgularımız, doz artışına paralel olarak 0.5mM ve 5mM CDME'nin, önce hücre içi sistin düzeylerini takibinde de özellikle prostat kanseri hücrelerinin apoptozisini arttırdığını göstermiştir. CDME'nin bu etkisini ise PKC? aktivasyonu ve PKC? inaktivasyonu üzerinden gerçekleştirdiğini saptadık. Ayrıca, PKC? genine spesifik küçük interferans RNA (siRNA) ile yapılan analizler PC3 hücrelerinin ölümünün PKC?'ya bağımlı olduğunu ifade etmiştir. Kontrol hücreye kıyasla özellikle prostat kanseri hücrelerinde gözlemlediğimiz bu sonuçlar, CDME'nin prostat kanseri tedavisinde kullanılacak olası terapötik ajanlardan biri olabileceğini göstermektedir.Anahtar Kelimeler: Prostat kanseri, PKC?, PKC?, sistin, CDME, apoptozis

The molecular basis of prostate cancer is strongly related with inactivation of pro-apoptotic, tumor-suppressive isozyme protein kinase C-? (PKC?) and activation of growth-stimulatory, oncogenic isozyme PKC?. Oxidative conditions altered in cancer lead to change the structure both of PKC isozymes containing cysteine rich residues. Disulfide forms of thiol antioxidants induce marked changes in PKC isozyme activity via S-cysteinylation (PKC-S-S-Cys), e.g. PKC? stimulation and PKC? inactivation. We aimed to investigate the oxidative regulatory responses of PKC? and PKC? to cystine dimethylester (CDME), a metabolic precursor of cystine, in various prostate cancer cells. For this purpose, cell cytotoxicity to select CDME doses for further assays by WST-8 assay based on the reduction of WST-8 to formazan, CDME-induced intracellular cystine levels by radioactive cystine binding protein (CBP) assay, apoptosis by DNA fragmentation and Calcein AM assays, the protein expressions of PKC? and PKC? by western blot, and both PKC enzyme activities by nonradioactive assay were performed in prostate cancer cells, LNCaP (androgen-dependent prostate cancer cell line) and PC3 (androgen-independent prostate cancer cell line), and RWPE-1 (nontumorigenic prostate epithelial cell line) used as control. Our findings showed that 0.5 mM and 5 mM CDME induced intracellular cystine levels and then apoptosis depending on enhanced concentration of CDME especially in prostate cancer cells. Additionally, we obtained that this effect of CDME arised from activation of PKC? and inactivation of PKC?. The inhibition of PKC? gene expression by specific small interfering RNA (siRNA) proved the cell death of PC3 depending on PKC?. These findings obtained in prostate cancer cells compared with control cell provide that CDME may be one of the potential therapeutic agents to use in prostate cancer therapy.Keywords: Prostate cancer, PKC?, PKC?, cystine, CDME, apoptosis