Pichia pastoris alkol oksidaz (AOX1 ve AOX2) genlerinin inaktif edilmesi ve elde edilen suşun rekombinant protein üretiminde kullanılması

Abstract

Pichia pastoris, biyoteknoloji, ilaç endüstrisi ve akademik araştırmacılar tarafından rekombinant protein üretimi için ihtiyaç duyulan bir ekspresyon sistemidir. P. pastoris, bakteriler gibi, tek karbon kaynağı olarak metanol, glukoz, gliserol veya etanol içeren ucuz besiyerlerinde hızla gelişme gösterebilmektedir. Ayrıca, insanlar gibi, ökaryotik bir organizmadır ve böylece hücre içi ortamı ökaryotik proteinlerin katlanması bakterilere göre daha iyi olanak sağlamaktadır. Buna ilaveten proteolitik işlemler, disülfit köprüsü oluşumu ve glikozilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.P. pastoris'in genomunda alkol oksidaz geninin iki kopyası bulunmaktadır. AOX1 geni hücrede alkol oksidaz aktivitesinin %85'inin regülasyonundan sorumlu iken, AOX2 geni alkol oksidaz aktivitesinin %15'inden sorumludur. Bu sebeple, rekombinant protein üretiminde AOX1 promotoru daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Metanol kullanım yeteneklerine göre 3 tip P. pastoris konukçu suşu bulunmaktadır. Çoğu suş metanolde doğal tip oranında gelişir (Mut+, metanol kullanımı pozitif fenotip). Diğer konukçu suşların (Muts ve Mut-) bir veya iki AOX geni de silinmiştir. Bazen AOX genleri silinmiş suşlar, rekombinant protein üretiminde doğal tip suşlardan daha iyi olabilmektedir. Ayrıca bu suşlar ekspresyon tetiklemesi için daha az metanol gerektirmektedir. Büyük ölçekli fermentasyonlar için az miktarda metanol gereksinimi, Mut- suşunu diğer suşlara göre avantajlı kılmaktadır.Çalışma iki bölümden oluşmaktadır. İlk bölümü, P.pastoris'te AOX genlerinin (AOX1 ve AOX2) inaktif edilmesidir. AOX1 ve AOX2 genleri, sırası ile ADE1 ve HIS4 genlerinin entegrasyonu ile inaktif edilmiştir. ADE1 ve HIS4, aynı zamanda seçici markırlardır. Bu bölümün sonucu olarak, P. pastoris MK321 (his4

Pichia pastoris is an expression system for the production of recombinant proteins needed by the biotechnology and pharmaceutical industries and by academic researchers. Like bacteria, P. pastoris grows rapidly on inexpensive media containing methanol, glucose, glycerol or ethanol as a sole carbon source. Furthermore, like humans, it is also a eukaryotic organism with a subcellular environment more conducive to the folding of eukaryotic proteins and with an ability to perform post-translational modifications such as proteolytic processing, disulfide bridge formation and glycosylation.The genome of P. pastoris contains two copies of the alcohol oxidase gene. The AOX1 gene is responsible for 85% of alcohol oxidase regulation within the cell while AOX2 gene is responsible for %15. Therefore if is the AOX1 promoter which is more widely used in recombinant protein production. P. pastoris has three different phenotypes depending on methanol utilization ability. Mut+ strain is indistinguishable from wild-type methanol utilizing strain. Muts (AOX1 gene is defective) and Mut- (AOX1 and AOX2 genes are defective) strains can be better than wild-type in recombinant protein production. In addition, these strains require less methanol for induction of expression. Less methanol requirement is an advantage of Mut- strains in large scale fermentation.This research consists of two parts. In the first part the objective was the inactivation of AOX genes (AOX1 and AOX2) in P. pastoris. AOX1 and AOX2 were inactivated by inserting ADE1 and HIS4 genes, respectively. ADE1 and HIS4 genes were also selection markers. As a result of this part, P. pastoris MK321 (his4