Bacillus sp. kaynaklı pullulanaz enzimini kodlayan genin klonlanması ve ekspresyonu üzerine çalışmalar

Abstract

Bu çalışmada Bacillus sp. kaynaklı pullulanaz geninin izole edilmesi ve Pichia pastoris'te pullulanaz enziminin rekombinant üretimi üzerine çalışılmıştır. Gen kaynağı olarak, daha önce tamamlanmış bir çalışma ile sünmüş ekmekten izole edilmiş olan Bacillus suşları taranmıştır. Pullulanaz geni, moleküler biyoloji yöntemleri kullanılarak B. subtilis BK07 izolatında bulunmuştur ve izole edilmiştir. Elde edilen genin C-ucuna PZR yolu ile çoklu histidin etiketi eklenmiştir. Histidin etiketli gen, pPICZ?A vektörüne bağlanmış ve P. pastoris KM71H suşuna aktarılmıştır. Ardından metanol indüksiyonlu protein üretimi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada B. subtilis PY22 suşu pozitif kontrol olarak kullanılmış ve analizler bu suş için de eş zamanlı olarak gerçekleştirilmiştir.P. pastoris'te üretilen BK07 ve PY22 pullulanaz enzimlerinin optimum çalıştığı koşullar, sırası ile pH8-40°C ve pH6-40° olarak saptanmıştır. BK07 pullulanaz aktivitesi 8,46 U/ml, PY22 pullulanaz aktivitesi 2,95 U/ml olarak tespit edilmiştir. Spesifik enzim aktiviteleri ise sırası ile 144 U/mg ve 51 U/mg olarak saptanmıştır. SDS-PAGE ve Western blot analizleri BK07 pullulanazının moleküler ağırlığının yaklaşık 81 kDa, PY22 pullulanazının ise yaklaşık 90 kDa olduğunu göstermiştir.ANAHTAR KELİMELER: Pullulanaz, Pichia pastoris, Bacillus sp., Rekombinant protein üretimi

This study focuses on isolation of the pullulanase gene from Bacillus sp. and recombinant production of the enzyme in Pichia pastoris. Bacillus strains isolated from ropey bread in a previous study were screened as sources of the gene and B. subtilis BK07 was used as the gene source. Pullulanase gene which was amplified with PCR to include a polyhistidine tag was transformed into P. pastoris KM71H yeast using the pPICZ?A vector and the enzyme production was achieved by methanol induced expression. In all steps, B. subtilis PY22 was used as positive control of the analysis.Optimum pH and temperature conditions for BK07 and PY22 pullulanase were investigated. Optimum pH and temperature was found as pH8-40°C and pH6-40°C, respectively. BK07 pullulanase activity was determined as 8.46 U/ml in supernatant and specific activity of the enzyme was calculated as 144 U/mg. PY22 pullulanase activity was determined as 2.95 U/ml in supernatant and specific activity of the enzyme was calculated as 51 U/mg. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the molecular weight of the recombinant enzyme BK07 pullulanase and PY22 pullulanase were determined to be about 81 kDa and 90 kDa, respectively.KEYWORDS: Pullulanase, Pichia pastoris, Bacillus sp., Recombinant protein production