Bacillus megaterium` dan proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada Bacıllus megaterium'dan proteaz enziminin kısmi olarak saflaştırılması ve karakterizasyonu araştırılmıştır. Bacillus megaterium ağırlık/hacim olarak % 0,5 maya eksraktı, %1 pepton , %1 glukoz, %1 tripton içeren besiyerinde 37 0C'de 24 saat süresince çoğaltılmıştır. Proteaz enzimi, %80 amonyum sülfat çöktürmesi ve DEAE selüloz anyon değişim kromatografisiyle %7,68 verimle ham ekstrakta göre 5,18 kat saflaştırılmıştır. Enzimin spesifik aktivitesi 1136 U/mg'dır. Enzimin optimum pH ve sıcaklığı sırası ile 12 ve 70 0C'dir. Enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde Ca2+ , Mg2+ ve Fe+3 enzim aktivitesini arttırırken K+1,Sn+2, Ni+2,Cu+2 ve Al+3 varlığında aktivitede kayıp gözlenmiştir. Co+2 ve Sr2+ iyonlarının ise enzim aktivitesi üzerine bir etkisi olmamıştır. Enzim kazein, jelatin, soya fasulyesi unu, BSA ve ovalbumin (Yumurta albumini), gibi doğal substratlar karşısında en yüksek aktiviteyi kazeine karşı göstermiştir. DMSO, 2-propanol, toluen, metanol enzim aktivitesini arttırırken Etanol herhangi değişikliğe sebep olmamıştır. Aseton ve asetonitril çok az miktarda aktiviteyi düşürmüştür. Deterjan katkı maddelerinden olan SDS aktiviteyi %31 oranında arttırmıştır. TritonX-100 aktiviteyi %40 aranında azaltırken, H2O2 nin %2'lik ve %5'lik her iki çözeltiside aktiviteyi %25 oranına kadar düşürmüştür. Enzim alkali proteaz inhibitörü olan PMSF tarafından inhibe edilmiştir. EDTA varlığında ise aktivitesinde çok az düşüş gözlenmiştir. Bu inhibisyon profili enzimin serin alkali proteaz olduğunu ve aktif merkezinin yakınında serin kalıntılarının bulunduğunu göstermiştir. Saflaştırılan enzimin Km ve Vmaks Kinetik parametreleri kazein subsratı kullanılarak sırasıyla 0,77 mg/ml, 3,58 µmol.ml-1 .dak-1 olarak bulunmuştur.

In this study, partially purification and characterization of protease from Bacillus megaterium was investigated. Bacillus megaterium who is produce Protease enzyme was grown in %1 tryptone, %1 peptone, %0,5 yeast extract, %1 glucose at 37 0C and 24 hour. Enzyme which is protease was purified by %80 ammonium sulfate precipitation. Protease was purified by with DEAE cellulose anion exchange chromatography %7,68 yield, 5,18 fold and specific activity was 1136 U/mg. The optimum pH and temperature of protease was 12 and 70 0C, respectively. While Ca2+ , Mg2+ and Fe+3 increased protease activity, some other metals such as K+1,Sn+2, Ni+2,Cu+2 and Al+3 decreased enzyme activity, Co+2 and Sr2+ showed no effect on protease activity. Protease showed highest activity towards casein among other native proteins such as ovalbumin, gelatin, BSA, soy bean. While enzyme activity increased in the presence of DMSO, 2-Propanol, Toluene, Methanole but in the presence of acetone and acetonitrile enzyme activity has been decreased slightly, enzyme activity maintained in the presence of ethanol. Enzyme activity increased %31 in the presence of Detergent additive material SDS, on the other hand enzyme decreased %40 and %75 in the presence of Detergent additive material TritonX-100 and oxidation material H2O2(%2 and %5), respectively. Enzyme was inhibited by alkalinprotease inhibitor PMSF. This inhibition profile showed that us enzyme was serin alkalinprotease. The kinetic parameters Km and Vmax of the purified protease were determined by measuring the protease activity casein as a substrate 0,77 mg/ml, 3,58 µmol.ml-1 .dak-1 respectively.