Endotel hücre kültürlerinde kalsiyum alışverişinin düzenlenmesi ve Defibrotid`in rolü

Abstract

-2- OZET Vasküler bozukluklann tedavisinde kullanılan bir ilaç olan defibrotid antitrombotik, profibrinolitik ve antiiskemik etkileri ile dikkati çekmektedir. Defibrotidin antitrombotik ve profibrinolitik etkisini endotel hücrelerinden PGI2, PGE2 ve TPA salgılanmasını arttırarak gerçekleştirdiği gösterilmiştir. Birçok değişik parametrenin aynı anda etkilenmesi önemli bir hücre içi veya hücre zarı mekanizmasının etkilendiği izlenimini yaratmıştır. Bu sebeple hücre içi kalsiyum düzeylerine defibrotidin etkisi araştırılmıştır. Bu işlem için insan göbek kordon endotel hücreleri cam lamellere ekilmiş ve tek tabaka hücre kültürlerinde fura2 ile dual exitasyon tekniği ile ölçümler yapılmıştır. Kullanılan dalga boylarında defibrotifin yüksek fluoresans vermesi sonuçların otofluoresans dikkate alınarak düzeltilmesine neden olmuştur. Defibrotid lmg/ml dozda tek başına uygulandığında bazala göre hücre içi serbest kalsiyum konsantrasyonunda 5-10 kat artma meydana getirmektedir. Hücreler defibrotid ile kalsiyum bulunmayan bir tamponda uyarıldığında küçük bir kalsiyum artışı olmaktadır fakat aynı hücreler içinde 1.8 mM kalsiyum bulunan bir tampona yerleştirildiklerinde ani olarak hücrelerde yüksek bir kalsiyum artışı olmaktadır. Bu sonuçlar defibrotidin arttırdığı kalsiyumun büyük bir oranda hücre dışı ortamdan desteklendiğini göstermektedir. Defibrotidin kronik uygulanmasında hücre içi kalsiyum sinyal iletim mekanizmasına olan etkisini araştırmak için 100 ng/ml defibrotid içeren medyum ile büyütülen hücreler ATP ve histamin ile uyarılmıştır. Sonuçta defibrotid ile büyütülmüş hücrelerin bu agonistlere verdikleri kalsiyum cevaplarının defibrotidsiz medyumda büyütülmüşlere göre daha yüksek olduğu görülmüştür. Anahtar kelimeler: Endothelium, Defibrotide, Calcium

-3- REGULATION OF CALCIUM EXCHANGE IN ENDOTHELIAL CELL CULTURES AND EFFECT OF DEFİBROTDE. Defibrotide, a drug used for treatment of some vascular disorders has antithrombotic, profibrinolytic, and antiischemic effects. The antithrombotic and profibrinolytic effect of defibrotide is due to its induction of PGI2, PGE2 and TPA from endothelial cells. Having such a wide spectrum of effects, it was evident that defibrotide should have a specific effect on a pivotal mechanisms such as cytoplasmic calcium levels ( [Ca2+]i ). The effect of defibrotide on [Ca2+]i of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) grown on glass coverslips were measured with fura2 loaded cell monolayers by dual wavelength excitation flourometry. Autoflourescence of defibrotide required the results to be corrected in each experiment lowering the resolution of the assay to a certain extent. Our results shows that: Defibrotid at 1 mg/ml increases ICa2+]j of HUVEC 5-10 times when the lCa2+]oul is 1.8 mM. Defibrotide gives a small [Ca2+]j peak in Ca2+ free enviroment suggesting a minimal release from internal stores. When the cells are exposed to 1.8 mM Ca2+ a large [Ca2+li peak is observed. These results indicate that increase in lCa2+]j of HUVEC by defibrotide is greatly supported by extracellular Ca2+. We have also investigated the effect of long term exposure to defibrotide on Ca2+ signalling mechanism of HUVEC. Cells grown in medium containing 100 ng/ml defibrotide have greater Ca2+ response to ATP and histamin than cells grown in defibrotide free medium. Key words: Endothelium, Defibrotide, Calcium