HBV genomunun prekor-kor ve x bölgelerine özgü mutasyonların ileri moleküler yöntemler ile saptanması

Abstract

IV 3. ÖZET Yurtdışında son yıllarda, ileri moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak, HBV'nin genomik yapısının araştırılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. HBV enfeksiyonunun ciddi seyirli olması, kronikleşmesi ve tedaviye yanıtsız kalması konağın dışındaki etkenlerle de ilişkilendirilmek- tedir. HBV genomunun Prekor-Kor bölgesinde saptanan bazı mutasyonlar, özellikle de Akdeniz ülkelerinde sık görülen HBe Ag'nin sentezlenmesini engelleyerek, virüsün konağın bağışıklık sisteminden kurtulmasına neden olan A1896mutasyonu bu durumlardan sorumlu tutulmaktadır. Bu çalışma, ülkemizin HBV enfeksiyonu yönünden endemik olması, bir Akdeniz ülkesi olması ve HBV genomunun baz dizisine ilişkin moleküler düzeyde çalışmaların bildiğimiz kadarı ile ülke koşullarımızda gerçekleştirilmemiş olması temel alınarak, Marmara Üniversitesi (M.Ü.) Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilim Dalı işbirliği ile M.Ü. Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalında planlanmıştır. Bu amaçla yürütülen çalışmada, serum ve doku HBV DNA varlığı, dot blot hibridizasyon ve Digoksigenin İn Situ Hibridizasyon (DİSH) yöntemleri ile gösterildi; HBV genomuna ilişkin A1896 ve/veya diğer mutasyonların varlığı ise, DNA dizi analizi, mutasyon belirleyici dot blot hibridizasyon ve Amplifikasyona Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS), Amplifikasyon İle Yara tılan Restriksiyon Kesim Noktası (Amplification Created Restriction Site - ACRS) gibi Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Restriksiyon Endonükleaz (RE) kesimine dayalı ileri moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak saptandı. Çalışmada akut ve kronik hepatitli 170 olgunun serumu dot blot hibridizasyon yöntemi ile incelendi ve 87 olgu serum HBV DNA yönünden pozitif bulundu. 12 olgunun karaciğer ince iğne aspirasyon biyopsi örnekle rinde HBV DNA varlığı DİSH yöntemi ile incelendi ve 10 olgu doku HBV DNA yönünden pozitif bulundu. Anti HBe pozitif kronik hepatit B enfeksiyonlu 17 olgu, HBV genomunun Prekor-Kor ve bir kısım X gen bölgeleri yönünden DNA dizi analizi ile incelendiğinde, 4 olguda A1896 stop kodon mutasyonuna ek olarak çeşitli nokta mutasyonlarına rastlandı. Bu 4 olguda DNA dizi analiziyöntemiyle saptanan A1896 mutasyonunun varlığı ayrıca, bilinen bir mutasyonu saptamaya olanak tanıyan dot blot hibridizasyon, ARMS ve ACRS yöntemleri uygulanarak da doğrulandı. Çalışmada ayrıca, HBV genomunun Prekor-Kor ve bir kısım X gen bölgelerinde şimdiye dek yayınlanmış mutasyonlara ek olarak, hiç tanımlan mamış nokta mutasyonlarına da rastlanmıştır. Bunlar: Prekor bölgesinde kodon 10, 11 ve 17'de ve X geninde kodon 104, 105, 116, 117, 120, 122, 123, 128, 129 ve 145'te saptanan nokta rotasyon larıdır.

VI 4. SUMMARY In recent years, by the use of advanced molecular techniques, a lot of progression has been accomplished in the field of HBV genome analysis. The tendency of HBV to cause a more severe and a chronic disease in certain cases and the reason of poor or intermittant response to therapy in those patients have been related to facts other than that of the host. Specific mutations in the precore region of HBV genome, especially the A1896 stop codon mutation, which is mostly seen in Mediterranean countries and which abolishes the synthesis of HBeAg, thereby causing the virus to escape from the immune system of the host, have been hypothesized to be responsible for such cases. This study has been planned and performed by Marmara University, Medical Faculty, Department of Medical Biology and Genetics with the cooperation of Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, by taking into consideration the facts that, Turkey is an endemic country in terms of HBV infection, is also a Mediterranean country where the frequency of A1896 stop codon mutation may also be high. No study being conducted to enlighten the base sequence of HBV genome in Turkey was another stimulus for the realisation of this study. In this study, presence of HBV DNA in serum and tissue has been shown by dot blot hybridization and Digoxigenin In Situ Hybridization (DISH) methods respectively. Presence of A1896 stop codon mutation or other mutations of HBV genome have been detected by the use of advanced molecular techniques such as DNA sequence analysis, mutation detecting dot blot hybridization, Amplification Refractory Mutation System (ARMS) and Amplification Created Restriction Site (ACRS). These are techniques mainly based on Polymerase Chain Reaction (PCR) and/or restriction endonuclease digestion (RE). Sera from 170 patients with acute and chronic HBV infection were analysed by dot blot hybridization and 87 cases were found to be positive forVII HBV DNA. Liver thin needle aspiration biopsy samples of 12 cases were analysed for the absence of HBV genome by DISH and 10 of them were found to carry HBV DNA in their liver tissues. 17 anti-HBe (+) chronic hepatitis B cases were analysed by direct sequencing of PCR amplified HBV DNA and 4 cases were found to have A1896 stop codon mutation. This specific mutation has also been confirmed by other techniques such as ARMS, ACRS and mutation detecting dot blot hybridization. In addition to mutations that were published earlier, some unidentified mutations have also been detected in this study. These mutations are point mutations detected in codon 1 0, 1 1 and 1 7 of Precore region and codon 1 04, 105, 116, 117, 120, 122, 123, 128, 129 and 145 in X open reading frame of HBV genome.