Uzun kodlamayan RNA ZEB2NAT‟ın MCF7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarında EMT, metastaz ve apoptoz üzerinden etkilerinin araştırılması

Abstract

Kadınlarda yaygın olarak görülen meme kanseri, kansere bağlı ölüm oranları dikkate alındığında ikinci sırada yer almaktadır. Kanser üzerine yapılan çalışmalarda genellikle gen ifadesi üzerine odaklanılmış olmasına rağmen artık kodlamayan RNA'larında önemi anlaşılmıştır. Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA) kodlamayan RNA ailesinin bir üyesidir. lncRNA'ların EMT (Epitelyal-mezenkimal geçiş), metastaz ve apoptoz gibi farklı süreç ve yolaklarda görevli genlerin düzenlenmesinde önemli işlevleri olduğu bilinmektedir. Bu nedenle de kanser patogenezinin moleküler düzeyde anlaşılmasına katkıda bulunması kaçınılmazdır. lncRNA ZEB2NAT, EMT sürecinde önemli role sahip ZEB2'nin doğal antisense transkriptidir. Bu tez çalışmasında MCF7 ve MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinde lncRNA ZEB2NAT'ın EMT, metastaz ve apoptoz üzerinden etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.ZEB2NAT'ın ifadesi siRNA transfeksiyon metodu ile baskılanmıştır. ZEB2NAT'ın MCF7 ve MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinde EMT, metastaz ve apoptozda önemli olan genlerin ifadeleri üzerine etkisi gerçek-zamanlı PZR (qPZR) ile belirlenmiştir. Önemli değişim görülen genlerden ZEB2, E kaderin ve N kaderinin protein seviyeleri western blot yöntemi ile kontrol edilmiştir. ZEB2NAT'ın hücre proliferasyonu, apoptoz, invazyon ve koloni oluşturma kapasitesi üzerine etkisi sırasıyla XTT, FITC annexin V, invazyon ve koloni testleri kullanılarak değerlendirilmiştir. ZEB2NAT'ın baskılanması her iki hücre hattında da EMT, metastaz ve apoptozda önemli olan bazı genlerin ifadelerini anlamlı derecede değiştirerek antimetastatik ve apoptotik etkiye sahip olduğu qPZR analizi ile tespit edilmiştir. ZEB2NAT'ın baskılanması durumunda her iki hücre hattında da gen ifadelerinde anlamlı değişim görülen ZEB2 ve N kaderin protein ifadelerinin azaldığı E kaderin protein ifadesinin ise arttığı protein düzeyinde western blot analizi sonucunda belirlenmiştir. Ayrıca XTT testi sonuçlarında ZEB2NAT'ın baskılanmasının her iki hücre hattında da hücre çoğalmasını anlamlı derecede azaltıcı etki gösterdiği belirlenmiştir. Akım sitometri sonuçları ZEB2NAT'ın baskılanmasının her iki hücre hattında da apoptozu anlamlı derecede uyardığını göstermiştir. İnvazyon ve koloni testleri sonucunda ZEB2NAT'ın baskılanmasının her iki hücre hattında da belli oranlarda sırasıyla invazyon ve koloni oluşum kapasitelerini anlamlı derecede azalttığı saptanmıştır.ZEB2NAT'ın baskılanması hem MCF7 hemde MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinde anti-metastatik ve apoptotik etkiye neden olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar EMT sürecinde önemli role sahip olan ZEB2 transkripsiyon faktörünün antisense transkribi olan ZEB2NAT'ın meme kanserinde EMT, metastaz ve apoptoz üzerinden önemli rollere sahip olduğunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Apoptoz, EMT, meme kanseri, metastaz, ZEB2NAT.

Breast cancer, which is common in women, is the second considering the most common cancer-related mortality. Although studies on cancer have been generally focused on gene expression, importance of non-coding RNAs have been also understood. Long non-coding RNAs (lncRNA) are member of the non-coding RNA family. It is known that lncRNAs have important functions in the genes regulation of role in the different processes and pathways such as EMT (Epithelial-mesenchymal transition), metastasis and apoptosis. Therefore, it is inevitable that lncRNAs have potential contribution for the understanding of cancer pathogenesis at the molecular level. lncRNA ZEB2NAT is the natural antisense transcript of ZEB2, which has an important role in the EMT process. In this thesis, the objective was to investigate effects of lncRNA ZEB2NAT via EMT, metastasis and apoptosis in MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cell lines.The expression of ZEB2NAT was suppressed by the siRNA transfection method. The effect of ZEB2NAT on the expression of important genes in EMT, metastasis and apoptosis was determined by real-time PCR (qPCR) in MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells. The protein levels of ZEB2, E cadherin and N cadherin were investigated by western blot analysis. The effects of ZEB2NAT on cell proliferation, apoptosis, invasion and colony formation were evaluated using XTT, FITC annexin V, invasion and colony tests, respectively.Expression of some important genes in EMT, metastasis and apoptosis pathways in both cell lines was determined by qPCR analysis. It was thereby suggested that the suppression of ZEB2NAT revealed anti-metastatic and apoptotic effects. The suppression of ZEB2NAT resulted in a decrease in ZEB2 and N cadherin and an increasing in E cadherin protein levels by western blot analysis in both cell lines. In addition, it was determined that suppression of ZEB2NAT significantly decreased cell proliferation in both cell lines in the XTT test. The results of flow cytometry showed that suppression of ZEB2NAT significantly stimulated apoptosis in both cell lines. As a result of invasion and colony tests, it was found that suppression of ZEB2NAT significantly decreased invasion and colony formation capacities in both cell lines.It was shown that suppression of ZEB2NAT caused anti-metastatic and apoptotic effect in both MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells. These results have suggested that ZEB2NAT, the antisense transcript of the ZEB2 transcription factor, has an important roles in EMT, metastasis and apoptosis in breast cancer.Keywords: Apoptosis, EMT, breast cancer, metastasis, ZEB2NAT.