Düşük dansiteli lipoprotein (LDL) ve okside düşük dansiteli lipoprotein`in (o-LDL) nitrik oksit (NO) aracılı trombosit aktivasyonuna etkilerinin incelenmesi

Abstract

Trombositler ve lipoproteinler ateroskleroz ve koroner kalp hastalıklarınınpatogenezinde önemli rol oynarlar. Bu çalışmada insan plazmasından izole edilen LDLve LDL'nin oksidasyonu ile elde edilen okside LDL'nin (o-LDL) trombositaktivasyonu üzerine olan etkilerinin trombosit L-arjinin ve NO yoluyla ilişkisininaydınlatılması amaçlanmıştır.Kesikli dansite gradient ultrasantrifügasyon yöntemi kullanılarak LDL ve HDLfraksiyonları insan plazmasından saflaştırılarak elde edildi. LDL ve HDL'nin saflıklarıtrigliserit , total kolesterol , apoprotein düzeyleri ve lipoprotein jel elektroforezi ilebelirlendi. Elde edilen LDL'nin bir kısmı Cu++ ile okside edilerek o-LDL elde edildi.o-LDL'nin lipid peroksidasyon düzeyi malondialdehid tayini ile belirlendi.Bu çalışmada sağlıklı 7 kişiden alınan kan örneklerinden izole edilen yıkanmıştrombositler öncelikle L-arjinin (1mM) ve L-nitroarjinin metil ester (L-NAME, 1 mM)ile inkübe edilerek Nitrik oksid metabolitlerinin (NOx) düzeyi saptandı. Daha sonraAdenozin difosfat (ADP) indüklü trombositler ortamda L-arjinin varken veya yokkenLDL (100 ?g/ml) , HDL (100 ?g/ml) ve o-LDL (100 ?g/ml) ile ayrı ayrı inkübe edildi.İnkübasyon sonrası trombosit P-selektin ekspresyonları flov sitometrik olarak ölçüldü.Sonuçlar her bir trombosit başına spesifik antikor bağlama kapasitelerine çevrildi.L-arjinin ilavesi trombosit NO düzeylerini kontrol grubuna göre anlamlı olarakartırmıştır (p<0.001). L-NAME ile inkübe edilen trombositlerin NO düzeyleri L-arjininile inkübe edilenlerden anlamlı olarak düşüktür (p<0.001). LDL ve o-LDL trombositbaşına düşen P-selektin düzeylerini anlamlı olarak artırdı (p<0.001). Buna karşılıktrombositlere LDL ve o-LDL ile inkübasyon öncesi L-arjinin ilavesi P selektinreseptörü sayılarının sadece LDL ve o-LDL ilavesine göre anlamlı olarak azalmasınaneden oldu (p<0.01, p<0.001). Trombositlere o- LDL, L-arjinin ile birlikte HDLilavesi ise trombosit P selektin reseptör sayısının azalmasına neden oldu ( p<0.001 ).HDL ile birlikte L-arjinin ilavesi P-selektin sayıları daha da düşük bulundu.Sonuç olarak in vitro olarak önceden eksojen L-arjinin ilavesi trombosit NOdüzeylerini artışına neden olur, bu artış LDL'nin ve o-LDL'nin trombositaktivasyonunu artırıcı etkisini azaltır. HDL'de L-arjininin bu etkisini kuvvetlendirir.Anahtar kelimeler: NO, LDL, o-LDL, HDL, Trombositler.

Platelets and lipoproteins play an important role in atherosclerosis and coronary heartdiseases. The aim of this study was to investigate the relationship between Larginine/NO pathway and isolated lipoproteins from human plasma and oxidized LDL(ox-LDL). Human LDL and HDL were separated by density gradient ultracentrifugationand LDL was oxidized with Cu++ for 24 h at 37 °C. Purity of lipoproteins were assuredby triglyceride, total cholesterol, apoprotein levels and lipoprotein gel electrophoresis.Lipid peroxidation levels of ox-LDL were performed with MDA assay. L-arginine (1mM) and L-nitroarginine methylester (L-NAME, 1 mM) were treated with washedplatelets and Nitric oxide metabolites (NOx) level was measured. Adenosinediphosphate (ADP) induced washed platelets were incubated with LDL (100 ?g/ml) ,HDL (100 ?g/ml) and ox-LDL (100 ?g/ml) with or without L-arginine. Afterincubation, platelet P-selectin levels were measured by flow cytometry. The resultswere converted to specific antibody binding capacities per platelet.After treatment with L-arginine, platelet NO levels significantly increased compared tothe controls (p<0.001). Platelet NO levels decreased with L-NAME compared to Larginine(p<0.001). After incubation with LDL and ox-LDL, P selectin levels perplatelet significantly increased (p<0.001). On the other hand, P selectin levels inplatelets treated with L-arginine+LDL and L-arginine+ox-LDL decreased compared tothe levels in platelets treated with only LDL and ox-LDL (p<0.01, p<0.001). Additionof HDL to L-arginine+ox-LDL caused sifnificant reduction in P selectin receptornumbers per platelet as in the control values (p<0.001).We conclude that pretreatment of platelets with exogenous L-arginine causes enhancedendogen platelet NO levels and negates the effects of LDL and ox-LDL on plateletactivation and that HDL also strengthens this effect of L-arginine.Key Word: NO, LDL, o-LDL, HDL, Platelets.