Miksobakterilerden alfa-amilaz enziminin ayırımı ve saflaştırılması

Abstract

Ill ÖZET Bu çalışmada kullanılan miksobakteriler Antalya, Konya, İsparta illeri ile Şarkikaraağaç, Kulu ve Atabey ilçelerinden alınan 28 adet toprak örneğinden izole edilmiştir. İzole edilen bakterilerin tanı testleri yapılmıştır. Tam testlerine göre, izolatlardan KK2' nin Myxococcus fulvus, KK4' ün ise Myxococcus xanthus olduğu belirlenmiştir. MED5 Archcmgiıım cinsinden olmakla birlikte tür düzeyinde tanımlanamamıştır. ANT2, UNI1, KK1, KK3 ve KK4' ün ise Myxococcus, Angiococcıts, Archangium, Cystobacter, Melittanghım ve Stigmatella cinslerinden birine ait olduğu tahmin edilmektedir. MED4' ün Sorangium cinsine dahil olduğu düşünülmektedir. İzolatların tam olarak tanımlanabilmeleri için moleküler biyoloji teknikleri ile fılogenetik olarak sınıflandırılmaları gerekmektedir. Enzim aktivite tayininde; dekstrojenik enzim aktivitesini belirlemek amacıyla iki adet sakkarolitik enzim aktivitesini belirlemek amacıyla bir adet olmak üzere 3 farklı yöntem kullanılmıştır. İndikatör olarak 3,5-dinitrosalisilik asitin kullanıldığı dekstrojenik aktivite tayin yönteminin, indikatör olarak iyodun kullanıldığı sakkarolitik enzim aktivite tayin yöntemlerinden daha sağlıklı sonuçlar verdiği saptanmıştır. Buna göre 24 saat sonunda en yüksek a-amilaz aktivitesine sahip olan bakteri Myxococcus fulvus KK2 olarak belirlenmiştir. İzole edilen 19 adet miksobakteri arasında en yüksek enzim aktivitesine sahip olan M. fulvus KK2'den elde edilen alfa a-amilaz enzimi çeşitli basamaklarda saflaştırılmıştır. Bu amaçla iki deneme yapılmıştır. İlk denemede enzim proteinlerini çöktürmek amacıyla sırasıyla %40, %65 ve %80 amonyum sülfat dolgunlukları 2. denemede ise %20, %40 ve %65 amonyum sülfat doygunlukları kullanılmıştır. Bu işlemlerle ilk denemede enzim saflığı 0.9 kat, ikinci denemede 0.36 kez artmıştır. Daha sonra enzim diyaliz ve jel filtrasyon işlemine tabi tutularak saflık derecesi artırılmıştır. Jel filtrasyon işlemi ile ilk denemede enzim aktivitesi 883.272 U/mg'a çıkarılarak enzim saflığı 28.35 kez, ikinci denemede ise enzim aktivitesi 1754 U/mg'a çıkarılarak enzim saflığı 810 kez artırılmıştır. m 0 ANAHTAR KELİMELER: a- Alfa-amilaz, enzim saflaştırılması, Myxocoı0ıS > ti fulvus £

IV ABSTRACT In this study, 19 myxobacteria strains were isolated from 28 soil samples from different regions of Antalya, Konya, İsparta, Şarkikaraağaç, Kulu and Atabey. Identification tests were used to determine the genus of myxobacteria strains. According to identification tests, it was determined that KK2 isolate was Myxococcus fulvus, and KK4 isolate was Myxococcus xanthus. MED5 is in Archangium genus but it was not determined as in species. It was speculated that ANT2, UNI1, KK1, KK3 and KK4 belong to one of these genus, Angiococcus, Archangium, Cystobacter, Melittangium ve Stigmatella. MED4 was classified under Sorangium. Molecular techniques are needed to be able to describe isolates filogenetically. For enzyme activity test, two different methods were used for dextrogenic enzyme activity and another method was used for saccarolytic enzyme activity. 3,5- dinitrosalysilic acid was used an indicator. In dextrogenic activity test which was more dependable than the saccarolytic enzyme test in which lode was used as an indicator. It has been noted that Myxococcus fulvus KK2 had the highest a-amylase activity at the end of the 24 hour. a-Amylase, produced by Myxococcus fuhms KK2, which had the highest enzyme activity among 19 isolated myxobacteria was purified. Two trials were carried on for this reason. For the precipitation of the enzyme protein 40%, 65% and 80% ammonium sulfate concentrations were used in the first trial. In the second trial 20%, 40% and 65% concentrations were used. Enzyme purity was improved by this method. Then, dialysis and gel filtration methods were applied to increase enzyme purity. Enzyme activity reached 883.272 U and enzyme purity was increased 28.35 fold. Enzyme activity was recorded as 1754.99 U in the second trial and enzyme purity was increased 810.24 fold. KEYWORDS: Myxobacteria, a-Amylase, Myxococcus fulvus, enzyme purification