Enzim tutuklanmış polivinilferrosenyum perklorat modifiye elektrodu ile asetilkolin tayini

Abstract

Ill ÖZET Bu çalışmada, asetilkolinesteraz (AChE) ve kolin oksidaz (ChOx) enzimlerinin Pt elektrot yüzeyindeki polivinilferrosenyum perklorat matriksi içerisinde immobilize edilmesiyle, sulu çözeltide asetilkoline duyarlı yeni bir enzim elektrot hazırlanması amaçlanmıştır. Çalışmada öncelikle, serbest enzim sisteminin (asetilkolinesteraz ve kolin oksidaz) kinetik parametreleri incelenmiştir. Serbest enzim sisteminin maksimum akım verdiği pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 7,4 ve 65 °C olarak saptanmıştır. Serbest enzim sisteminin Michaelis-Menten sabitinin (Km) 1,58 mM asetilkolin ve aktivasyon enerjisinin (Ea) 76,95 kj / mol olduğu bulunmuştur. Enzim elektrodunun hazırlanmasında 0,1 M (tetrabutilamonyum perklorat) içeren metilen klorürdeki PVF (Polivinilferrosen)'in Pt elektrottaki elektroçöktürülmesiyle hazırlanan PVF+C1(V (Polivinilferrosenyum Perklorat) modifiye elektrodu kullanılmıştır. Enzimler polimer matriks olan PVF^CKV kaplanmış elektrot yüzeyine iyon değişim yoluyla tutuklanmıştır. PVF+C104` +E - > PVF4E+ C104` Enzimler polimerik yapıda elektrostatik olarak tutuklanmışlardır. AChE enzimi asetilkolinin, koline dönüşümünü, ChOx enzimi ise kolinin, H2O2 üreterek, betaine yükseltgenmesini katalizler. H202'nin yükseltgenmesi boyunca oluşan akımın polivinilferrosenyum merkezleri tarafından katalizlendiği bulunmuştur. Asetilkolin derişiminin, enzim miktarının, film kalınlığının ve uygulanan pH ve sıcaklığın enzim elektrot cevabı üzerine etkileri araştırılmıştır. Ayrıca girişim yapabilecek maddelerin etkileri de incelenmiştir. Cevap süresi 45-50 saniye ve lineer çalışma aralığının üst sının 1,17 mM asetilkolin derişimi olarak bulunmuştur. Immobilize enzim sistemi için görünür Michaelis-Menten sabiti (KMg) ve aktivasyon enerjisi (Ea) sırasıyla 1,74 mM asetilkolin ve 14,92 kj/moFdür. Serbest ve immobilize enzim sistemleri için bulunan Km değerleri oldukça yakındır. Bu da enzimin immobilizasyon sırasında hiçbir yapısal değişikliğe uğramadığını ve difüzyon sınırlamalarının olmadığını göstermektedir. Ayrıca enzim elektrot hazırlama metodu oldukça basit ve hızlıdır. Anahtar Kelimeler: Asetilkolin, Polivinilferrosen, Enzim elektrot

IV ABSTRACT The aim of this study is the preparation of a new enzyme electrode in order to determine the acetylcholine in the aqueous solition by means of acetylcholinesterase (AChE) and cholin oxidase (ChOx) enzymes immobilized in polyvinylferrocenium perchlorate matrix on the surface of Pt electrode. For this purpose, the kinetics of free enzyme system (acetylcholinesterase and choline oxidase) were investigated at the first step. The pH and the temperature which the free enzyme system yielded a maximum current were determined as 7.4 and 65 °C, respectively. İt was found that Michaelis-Menten constant (Kmg) of free enzyme is 1.58 niM acetylcholine and the activation energy (Ea) is 76.95 kj / mol. The construction of the enzyme electrode, polyvinylferrosenium perchlorate (PVF+C104`) modified electrode, has been prepared by the electroprecipitation of polyvinylferrosene on the Pt electrode in methylene chloride / 0. 10 M TBAP solution. Enzymes were immobilized into the polymer matrix by immersing (PYF+C104`) electrode in enzyme solution according to the ion exchange process; PVF+CI04` + E - ? PVF^E + CI04` The enzymes are held electrostaticaly in the polymeric structure. AChE catalyses the oxidation of choline to betaine, producing H2O2. Current due to H2O2 oxidation catalysed by polyvinylferrocenium centers was measured. The effects of acetylcholine concentration, the amount of enzymes, the film thickness and the operating pH and temperature on the response of the enzyme electrode were investigated. The effects of interferants were also studied. The response time was found to be 45-50 seconds and the upper limit of the linear working portion was found to be 1.17 mM acethylcholine concentration. The minimum substrat concentration that produced detectable current was l.OxlO`6 M acetylcholine concentration. The apparent Michaelis-Menten constant (KMapp) and the activation energy of this immobilized enzyme system were found to be 1.74 mM acetylcholine and 14.92 kj/mole respectively. Very close value of Km for immobilized and free enzyme system indicated that no diffusional limitations in the immobilized state and structural changes in the structure of the immobilized enzyme occured. In addition, the preparation method of the enzyme electrode was quite simple and rapid. Key Words: Acetylcholine, Poly(vinylferrocene), Enzyme electrode