Laktik asit bakterilerinin nitrik oksit (NO) üretiminin ve bunun biyojen amin oluşumuna etkilerinin belirlenmesi

Abstract

NO hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmalar açısından önemli işlevleri bulunan bir moleküldür. Bu nedenle farklı organizmalar tarafından üretilen NO'in endüstri ve sağlık koruma açısından biyoteknolojik ve tıbbi uygulama alanlarının aydınlatılması ve geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır.Bu araştırmada, nitrik oksit (NO) oluşturma yeteneğine sahip Lactobacillus plantarum (S1b, T119, Z1, Z2, Z3), Pediococcus aidilactici (S2, S3, S1a) ve Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum (P2, P10) türlerine ait 10 adet laktik asit bakterisi kullanılarak, nitrik oksit sintaz (NOS) enzimiyle NO üretimini sağlayan genlerin belirlenmesi üzerinde durulmuştur. NO üretiminde etkili olan bu mekanizmanın yanı sıra laktik asit bakterileri (LAB) tarafından üretilen NO aracılığıyla, gıdalarda biyojen amin oluşumunun engellenmesi de irdelenmiştir. Bu hedefe yönelik olarak gerçekleştirilen çalışmaların ilk aşamasında LAB'nin NO üretim miktarlarına depolamanın etkisi belirlenmiştir. Uzun süre depolamanın etkisiyle tüm suşların NO üretimlerinde azalma meydana gelmiş, NO en yüksek miktarda Pediococcus acidilactici S2 (15,058 ? M), en düşük miktarda L. plantarum Z3 (2,877 ? M) tarafından üretilmiştir.Nitratı substrat olarak kullanarak nitrat redüktaz üzerinden NO üretimi gerçekleştiren suşları, NOS enzimi ile üretim yapan suşlardan ayırabilmek amacıyla NOS engelleme denemeleri gerçekleştirilmiştir. NOS enziminin engellenmesinde NG-metil-L_ arjinin (L-NMA) kullanılmıştır. Deneme sonucunda, 500 ? M'lık L-NMA bileşiğinin 5 suşun (S1b, T119, Z1, Z2, Z3) NO üretimlerini %40'ın üzerinde azalttığı belirlenmiştir. Buna ilaveten suşların NOS enzim aktiviteleri de incelenmiştir.NOS gen bölgesinin saptanması amacıyla uygun primer çiftleri (6 adet) kullanılarak, suşlara ait genomik DNA'da PZR gerçekleştirilmiştir. PZR işlemi sonucu elde edilen PZR ürünleri agaroz jel elektroforezinde incelenmiştir. Ancak yapılan denemeler sonucunda genomik DNA'da NOS geni belirlenememiştir. NOS genine ait bilginin plazmit DNA'da bulunabileceği varsayımından hareketle bundan sonraki çalışmalar, bu konu üzerinde yoğunlaştırılmıştır. Yapılan denemeler sonucunda plazmit DNA'da da NOS gen bölgesi belirlenememiştir.NO'nun biyojen amin oluşumu üzerine etkilerinin belirlenmesi amacıyla öncelikle çeşitli ürünlerden izole edilen LAB'nin biyojen amin oluşturma özellikleri nitel ve nicel olarak belirlenmiştir. Biyojen amin üreten LAB ile NO oluşturma yeteneğine sahip LAB, biyojen aminlerin öncülü olan amino asitleri içeren MRS sıvı besiyerinde bir arada üretilmiştir. İnkübasyondan sonra suşların biyojen amin üretimlerinde meydana gelen değişimler HPLC ile saptanmıştır. Çalışmanın sonucunda NO üreticisi Lactobacillus plantarum T119 suşunun, A?09 suşunun oluşturduğu triptamin, ? -fenil etilamin, kadaverin, histamin ve tiramin miktarlarında önemli düzeyde azalmaya yol açtığı belirlenmiştir. Ancak NO, putresin üretimi üzerinde etkili olmamıştır. NO üreticisi Pediococcus acidilactici S2 ise A-09'un triptamin, kadaverin, histamin ve tiramin üretimlerini azaltmıştır.Anahtar Kelimeler: Nitrik oksit, Laktik asit bakterileri, Nitrik Oksit Sintaz, Biyojen amin.

Nitric oxide (NO) is a molecule which has important functions for animals, plants and microorganisms. It is very important that NO production from various microorganisms regarding to its industrial and health protective properties should be elucidated and developed for biotechnological and medical application areas.In this study, 10 NO producing lactic acid bacteria belong to Lactobacillus plantarum (S1b, T119, Z1, Z2, Z3), Pediococcus acidilactici (S2, S3, S1a) and Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum (P2, P10) were used to determine the genes that produce NO with nitric oxide synthase enzyme. Inhibition of biogenic amine formation via NO producing lactic acid bacteria (LAB) was also considered as well as the efficient mechanism of NO production. In this concept, the first step of the study was to determine the effects of storage on quantity of NO production by LAB. NO production of all strains decreased after a long term storage; Pediococcus acidilactici S2 (15,058 ? M) produced the highest quantity, whereas L. plantarum Z3 (2,877 ? M) produced the lowest amount.NOS inhibition experiments were carried out to differ NO producing strains via nitrate reductase which uses nitrate as substrate, from strains using NOS enzyme. NG-methyl-L_ arginine (L-NMA) was used for inhibition of NOS enzyme. At the end of the trial, it was determined that 500 ? M L-NMA substance caused over 40% reduction in NO production of 5 strain (S1b, T119, Z1, Z2, Z3). Furthermore, NOS enzyme activities of strains were also investigated.PCR was carried out for genomic DNA of strains using appropriate 6 primer pairs to determine NOS gene region. PCR products obtained from PCR application were investigated using agarose gel electrophoresis. However, after trials NOS gene in genomic DNA was not determined. It was hypothesised that NOS gene could be coded in plasmid DNA, and the research was directed towards plasmid DNA. As a result of the trials NOS gene area was not determined in plasmid DNA.Biogenic amine formation properties of LAB isolated from various products were determined qualitatively and quantitatively to demonstrate the effects of NO on formation of biogenic amines. Biogenic amine producing LAB and NO producing LAB were grown in MRS broth medium which had precursor amino acids of biogenic amines. After incubation the variations in biogenic amine production of strains were determined using HPLC. As a result of the study the quantities of tryptamine, ? -phenyl ethylamine, cadaverine, histamine and tryptamine produced by A-09 strain were significantly lowered by NO producer Lactobacillus plantarum T119. However, NO did not show any significant effect on putrecin production. NO producer Pediococcus acidilactici S2 reduced tryptamine, cadaverine, histamine and tyramine produced by A-09.Key Words: Nitric Oxide, Lactic acid bacteria, Nitric Oxide Synthase, Biogenic Amine.