Antalya ve Isparta illerinde karanfil üretim alanlarında karanfil beneklenme virüsü (Carnation mottle virus=CarmMV izolatlarının biyolojik ve moleküler karakterizasyonu

Abstract

Dünyada ve ülkemizde karanfil üretimi kesme çiçekler arasında önemli bir yere sahiptir. Karanfil yetiştiriciliğinde ekonomik kayıplara neden olan birçok fungal, bakteriyel ve viral hastalıklar bulunmaktadır. Viral hastalıklardan karanfil beneklenme virüsü (Carnation mottle virus, CarMV) karanfil yetiştirilen birçok ülkede yaygın olarak bulunmaktadır. Daha önce yapılan bir çalışmada Antalya ve Isparta illerinde karanfil üretim alanlarından 33 örnek toplanmış ve CTAB yöntemiyle toplam nükleik asit izolasyonu yapılmıştır. Daha sonra bu örneklerde iki aşamalı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyon (RT-PCR) yöntemiyle CarMV'ne ait kılıf protein (CP) genleri çoğaltılarak 33 tane örnekten 31 tanesinde 1000 bp büyüklüğünde CarMV CP genine denk gelen bant elde edilerek CarMV varlığı tespit edilmiştir. Bu çalışmada her iki il için seçilen 5'er izolat olmak üzere toplam 10 farklı CarMV izolatından çoğaltılan kılıf protein genleri T-A klonlama yöntemiyle pGEM-T Easy plazmitine klonlanarak Escherichia coli bakterisine aktarılıp koloniler elde edilmiştir. Her bir örnek için elde edilen beyaz kolonilerden en az beş tanesi seçilmiş ve koloni PCR yöntemiyle taranarak her bir örneğin kılıf protein genini içeren en az iki beyaz koloni belirlenmiştir. Bu kolonilerden plazmit izolasyonu yapıldıktan sonra plazmitler EcoRI enzimiyle kesilip CarMV kılıf protein geni içerdikleri doğrulanmıştır. Daha sonra, kılıf protein genlerinin dizilimi yapılarak bunların nükleotid dizilimi ve amino asit dizilimi belirlenmiştir. Bu diziler analiz edilerek ülkemizin iki farklı bölgesinden elde edilen CarMV izolatlarının CP gen dizilimleri birbirleriyle ve gen bankası veri tabanından alınan ve dünyanın farklı üretim bölgelerinden elde edilen CarMV CP genleriyle karşılaştırılarak benzerlik oranları ve filogenetik ilişkileri ortaya konmuştur. Ayrıca bu CarMV izolatlarının bazılarının otsu bitkilere inokülasyonları yapılarak biyolojik özellikleri belirlenmiştir.Anahtar kelimeler: Karanfil, karanfil beneklenme virüsü, RT-PCR, kılıf protein geni, DNA dizileme ve analizi

Carnation has an important place in cut flowers production in Turkey and the world. There are many fungal, bacterial and viral diseases causing economic losses in carnation. Among viral pathogens Carnation mottle virus (CarMV), commonly found in many carnation producing countries. In a previous study the presence of CarMV was determined in carnation production areas of Antalya and Isparta by two-step reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR). In this study, total of 33 samples were collected from 6 different carnation production greenhouses in Isparta and Antalya. Total nucleic acid was isolated from samples using CTAB method. Then, these samples were tested for presence of CarMV by RT-PCR method amplifying the CP genes and it was determined that 31 of 33 samples were infected with CarMV. In this study, ten different isolates representing Isparta and Antalya were selected and CP gene of these isolates were cloned in to pGEM T Easy by T-A cloning approach. After the transformation of the Escherichia coli a number of colonies potentially carrying the CarMV CP genes were obtained. For each sample at least five white colonies were screened by colony PCR and at least two colonies carrying the pGEM-T Easy plasmid with the CarMV CP gene were identified. Plasmids were isolated from these colonies and of the presence of CarMV CP gene in the plasmids was confirmed by EcoRI digestion. The CP genes were sequenced and their nucleotide and deduced amino acid sequences were determined. Similarity and phylogenetic relationship of the CP gene of Turkish CarMV isolates with each other and with the CP genes of CarMV isolates from different regions of the world were determined using the nucleotide and amino acid sequences. In addition, by making some of these CarMV isolates harbeceous plants, biologic properties of isolates were determined.Key words: Carnation, carnation mottle virus, RT-PCR, coat protein gene, DNA sequence and analyze