İnsan beta aktin proteini ile influenza virüsü RNA polimeraz enzimi arasındaki ilişkinin araştırılması

Abstract

Amaç: Orthomyxoviridae ailesi içerisinde yer alan İnfluenza A virüsleri sık sık tekrarlayan salgınlarla insan sağlığını tehdit eden önemli viral patojenlerdir. Bu nedenle çok sayıda bilim insanı İnfluenza virüslerinin konak hücrelerle olan ilişkisini moleküler düzeyde aydınlatmak için yoğun çaba sarfetmektedir. Viral RNA'ların transkripsiyonu ve replikasyonu PB1, PB2 ve PA alt birimlerinden oluşan RNA polimeraz enzimi tarafından kataliz edilmektedir. Bu tez çalışmasında, daha önce maya ikili hibrit metodu ile ilişkileri saptanan viral RNA polimeraz enziminin PA alt ünitesi ile insan beta aktin (ACTB) proteini arasındaki ilişki memeli hücrelerinde araştırıldı. ACTB proteinin influenza virüsü replikasyonu açısından öneminin ortaya konması amaçlandı.Gereç ve Yöntem: Memeli hücrelerinde ekspresyon yapan pCHA plazmitine klonlanmış insan ACTB cDNA'sından belirli ekzon bölgeleri ters PZR ile uzaklaştırıldı ve delesyonlu ACTB proteini kodlayan vektörler oluşturuldu. HeLa ve/veya HEK293 hücreleri ACTB ve delesyonlu ACTB proteinleri ile İnfluenza A virüsü PA proteinlerini kodlayan plazmit vektörler ile birlikte transfekte edildi. Bu hücrelerde birlikte sentez edilen ACTB ve viral PA proteinleri arasındaki ilişki birlikte immün çöktürme ve hücre içi lokalizsayonları immünfloresan teknikleri ile analiz edildi. Bulgular ve Sonuç: Birlikte immün çöktürme ve immünfloresan teknikler transfekte HeLa ve/veya HEK293 hücrelerinde plazmitler üzerinden sentez edilen ACTB ve İnfluenza PA proteinlerinin etkileşim halinde olduğunu ortaya koydu. Delesyonlu ACTB ve viral PA proteinlerinin gösterdikleri etkileşim profilleri, ACTB proteininin özellikte amino-terminal bölgesinin viral PA proteini ile ilişkili olduğu; bu ilişkide PA proteinin karboksil-terminal yarımının (cPA) önem taşıdığını gösterdi. Bu verilerden İnfluenza virüsü kurulumunda vRNP'lerin sitoplazmada taşınması sürecinde ACTB proteinlerinin rolü olabileceği sonucuna varıldı.Anahtar Kelimeler: İnfluenza, Viral RNA polimeraz, PA protein, İnsan beta aktin proteini, vRNP

Aim: Influenza A viruses within the Orthomyxoviridae family are important viral pathogens that frequently threaten human health with outbreaks. For this reason, many scientists are working intensively to enlighten the interaction of influenza viruses with host cells at the molecular level. The transcription and replication of viral RNAs is catalyzed by the RNA polymerase. In this study, the relationship between human ACTB protein and PA subunit of viral RNA polymerase enzyme, which was previously determined by yeast two-hybrid method, was investigated in mammalian cells. It was aimed to determine whether ACTB protein is important for influenza virus replication.Materials and Methods: Specific exon regions from ACTB cDNA cloned into the pCHA plasmid expressing in mammalian cells were removed by invers PCR and vectors encoding the deletion ACTB protein were generated. HeLa and/or HEK293 cells were co-transfected with plasmid vectors encoding ACTB and deleted ACTB proteins and viral PA proteins. The relationship between ACTB and PA proteins co-expressed in the cells was analyzed with co-immunoprecipitation and immunofluorescence assays.Results and Conclusion: Co-immunoprecipitation and immunofluorescence assays revealed that ACTB and Influenza PA proteins, synthesized via plasmids in transfected cells, are in association with each other. The interaction profiles of deleted ACTB and viral PA proteins show that the amino-terminal region of the ACTB protein is associated with viral PA protein; showed that the carboxyl-terminal moiety (cPA) of the PA protein was important in this relationship. From these data, it was concluded that ACTB proteins may play a role in the transport process of influenza virus vRNPs in the cytoplasm.Keywords: Influenza, Viral RNA polymerase, PA protein, Human actin beta protein, vRNP