Effect of chymotrypsin on M1 type pyruvate kinase from rabbit muscle and L-type from sheep liver

Abstract

M, ve L- tipi pürüvat kinaz enzimlerinin kimotiripsin kırılmasına karşı hassasiyeti çalışıldı. Koyun karaciğeri L-tipi pürüvat kinazı, sırası ile pH çöktürmesi, amonyum sülfat kesitlemesi, iyon değiştirici (DEAE Trisacryl M) yöntemleri kullanılarak izole edildi. Özgül aktivitesi 6.84 umole/min-mg protein olan L-tipi örnek ve ticari özellikteki özgül aktivitesi.0*8 umole/min-mg protein olan M, tipi örnek kul lanıldı. Aktivator ve substuratların protolitic kırılma hı zına etkileri gözlendi. İnaktivasyon kinetiği birincil dere cedendi. Bu iki enzimin ortak noktaları aşağıdaki gibidir. Enzimlerin substurata olan PEP etkili. bir şekilde iki enzimide inaktivasyona karşı korudu. Mg + iyonları yalnız başlarına ilave edildikleri zaman inaktivasyon hızına herhangi bir et kileri görülmedi. ADP, Mg + ADP ve FDP nin M, Ve L tipi _v-enzimler üzerindeki etkileri belirgin farklılıklar taşımak tadır. Bütün bu ligandlar (2mM.) kimotiripsin kırılmasına karşı M, tipi enzimi dengesiz hale getirdi. Ligandların et- 2+ kinlikleri sırası ile şöyledir. FDP>Mg ADP>ADP. ADP nin 2+ L-tipi enzimi Mg ADP ye göre daha fazla labilize etmesi enzimin dengesi üzerinde ters etki eden ve farklı özelliklerde birden fazla nükteotid bağlanma bölgesi olabileceğini düşündürdü. FDP L tipi enzimi kısımsal olarak korumakta ve bu ligandın bulunması ile zamana karşı çizilen yarı logaritmik kalan aktivite, bir eğri vermektedir. Bu eğrinin en az iki fazdan oluştuğu düşünüldü. Bu fazlardan koruyucu olanı dikkate değer bulundu. Bütün bu bulgular, detaylı protolitik çalışmaların M, ve L tipi puruvat isozimlerinin arasındaki yapısal fark- lıcalıklar ve onların kinetic etkileri ve düzenleyici davranışları hakkında değerli bilgiler vereceği sonucuna varıldı.

M. and L-type pyruvate kinases were studied with respect to susceptibility to proteolytic cleavage by chymotrypsin. L-type isozyme was isolated from sheep liver by the sequential use of pH precipitation, ammonium sulfate fractination, ion exchange chromotography (DEAE-Trisacryl M). Enzyme had a specific activity of 6.84 pmole/min-mg protein. The M, isozyme was a commercial product obtained from rabbit muscle and a specific activity 0.8 pmole/min-mg protein. The effect of substrates and activators on the rate of proteolytic cleavage were observed. The kinetics of inactivation was generally first order. Common points for these two isozymes were as follows IIIThe substrate, phosphoenolpyruvate, effectively protected both enzymes against inactivation. Magnesium ions, when added alone, had no effect on the rate of inactivation. The effect of ADP, Mg. ADP and fructose -1,6- diphosphate (FDP) on M. and L-type enzymes were markedly different: All these ligands (2mM) destabilized the M, isozyme against chymotrypsin cleavage- The order of effectiveness was FDP>Mg ADP>ADP. With the L isozyme ADP was more effective 2+ in labilizmg the enzyme than Mg.ADP suggesting that there might be more than one nucleotide binding site with different specificities and with opposing effects on the: stability of the enzyme. FDP had a partially-protective effect. In the presence of this ligand the semilogaritmic plot of remaining activity versus time was curved, indicating that the chymotryptic inactivation consisted of at least two steps. The protective effect of FDP was found to be significant on one of these steps. These results suggests that a detailed study of proteolysis may yield important information about structural difference between the M. and L type pyruvate kinases and their impact on the kinetic and regulatory behavior of these isozymes.